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        蛋白质内序列分析用肽段的分离与纯化实验

        相关实验:蛋白质内序列分析用肽段的分离与纯化实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        考马斯亮蓝 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液)

        乙酸 (5% 的 10% 甲醇溶液)

        甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液)

        SpeedVac 型旋转浓缩器(Savant Instruments,Inc.)

        Achromobacter 胰蛋白酶 I〔赖氨酰内肽酶;50ng/ul 的 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)〕

        Tween-20〔0.1% 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕

        UltrafreeTM MC 滤器(22um;Millipore Corp.)

        三氟乙酸(TFA;0.1% 的 50% 乙腈溶液)

        C18 反相 HPLC 柱 (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)

        乙腈

        2-丙醇

        操作程序

        1) 用 SDS-PAGE 分离待研究蛋白。

        2) 凝胶用 0.05% 考马斯亮蓝 G 染色 15~30 min。

        3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脱色。

        4) 在水中浸泡 10 min。

        5) 从凝胶上切下蛋白带,转移至微量离心管。切下一段不含蛋白质的凝胶作对照。如必要,可将凝胶切成较小的碎片,使之能容易地沉入微量离心管的底 部。

        6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室温下孵育 20 min。弃上清。

        7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室温下孵育 20 min。弃上清。

        8) 凝胶碎片在 SpeedVac 型旋转浓缩器中干燥 2 min。

        9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I。

        10) 各管加最小体积的含 0.1%Tween-20 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—刚够淹没凝胶碎片即可。
        注:凝胶碎片会膨胀, 故重要的是要保证它们仍能淹没在含去垢剂的缓冲液中。

        11) 各管 30℃ 孵育 24 小时。

        12) 各管在微量离心机中离心,将各管上清转移至 22-um Ultrafree MC 滤器内。12000r/min 离心 2 min。保留滤液。

        13) 加 1 体积含 0.1%TFA 的 50% 乙腈溶液于各管留下的凝胶碎片中--足够淹没凝胶碎片。4°C 孵育 30 min。

        14) 重复第 12、13 步操作。合并各样品的滤液。

        15) 样品在 SpeedVac 型旋转浓缩器中旋转浓缩至体积小于 100 ml。加适量 HPLC 平衡液,制成供 HPLC 分析用的样品。

        16) 用反相 HPLC C18 柱分离消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脱肽段。于 214mn(对肽键)和 295nm(对色氨酸)检测肽段的 UV 吸收。

        来源:丁香实验

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