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        酿酒酵母感受态细胞的制备、转化

        互联网

        17170
        酿酒酵母感受态细胞的制备

        (1)从YPD平板上挑取一个新鲜的酿酒酵母EBY100单克隆至10 ml YPD液体培养基,30℃,250 rpm 培养过夜。

        (2)测定过夜培养物的OD600值为3.0~5.0之间。

        (3)将10 ml YPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2~0.4。

        (4)在28~30℃摇床中继续培养3~6 hr,使其OD600值达到0.6~1.0。

        (5)于室温1500 g 离心5 min 收集酵母细胞,弃上清。

        (6)用10 ml 洗液洗酵母细胞,随后于室温1500 g 离心5 min离 心收集细胞,弃上清。

        (7)用1 ml TE/LiAc重悬酵母细胞,以每管50 μl 分装。

        酿酒酵母细胞的转化

        (1)取50 μl 感受态细胞,再加入待转质粒各2 μl,混匀。

        (2)加入500 μl 转化用溶液(PEG/LiAc,二甲亚砜),弹击管壁混匀。

        (3)30℃水浴1 h,隔15min弹击管壁混匀。

        (4)加入1毫升YPD培养液,30℃摇床培养1小时。

        (5)3500 g 离心5 min ,留沉淀,弃上清。

        (6)沉淀用150 μl TE重悬,涂相应的SD平板;将平板倒置于30℃培养。

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