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        感受态细胞的制备[电转化法]

        互联网

        21252

        体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子,人们摸索出了不同的方法处理细菌,使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中,并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。

        实验目的:学习感受态细胞的制备过程

        实验材料:大肠杆菌菌株DH5a或DH10B

        实验原理:电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔,因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞,以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109~1010 转化子/µg DNA;

        对于热激法,是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取外源DNA。转化效率为106 ~107转化子/µg DNA。

        CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

        1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时);

        2.取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm);

        3.将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤需在超净工作台和冰上操作

        4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟;

        5.4℃下3000 g冷冻离心5分钟;

        6.弃去上清,加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟;

        7.4℃下3000 g冷冻离心5分钟;

        8.弃去上清,加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

        9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超低温冷冻贮存备用(-70℃)。

        电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

        1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜;

        2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6(约2.5-3小时);

        3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

        4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟;

        5.4℃下3000g冷冻离心5分钟;

        附注:

        影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项:

        1)细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml);

        2)所有操作均应在无菌条件和冰上进行;

        3)经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);

        4)化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍);

        5)所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;

        6)质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的DNA;

        7)一定范围内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比;

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