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        农杆菌感受态的制备和转化

        最新修订时间:

        原理

        主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理,使农杆菌细胞膜的通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

        材料与仪器

        步骤

        一、农杆菌感受态细胞的制备


        1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养。


        2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。


        3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃ 220rpm振荡培养至OD600=0.5。


        4. 转入无菌离心管,5000rpm离心5min,去上清液。


        5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min,去上清。


        6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮。


        7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中,每管200μl冻存于-70℃。


        二、双元载体转化农杆菌EHA105


        1. 取1 μg左右的质粒DNA加入到200 ml EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min,-70℃放置10min 。


        2. 再在37℃水浴5min或42℃水浴1min。


        3. 接着冰浴2min,加入800ml YM液体培养基。


        4. 28℃,175rpm摇培3 hr后,涂在含50 μg/ml Kanamycin的YM平板上。


        5. 28℃培养到形成单菌落。


        注:其中 YM 可以用LB 代替 ,第一次的 CaCl2 溶液可用溶液(0.1MCaCl2   0.01Tris-HCl(7.0) 0.01 DTT)替代。

        来源:丁香实验

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