引物设计经验总结

引物序列的特异性是决定PCR特异性扩增的主要因素。现在我们常用引物设计软件来进行引物设计，但如注意到以下条件将会事半而功倍：

1. 引物长度在15～30 bp为佳，过长的引物与模板复性杂交速率减慢，降低扩增效率，过短则会降低特异性。

2. 引物内部不应形成二级结构，两引物之间不能互补。

3. 碱基应随机分布，（G+C）%最佳含量在45%～55%，应避免4个以上的相同碱基排列。

4. 引物3’端和模板的碱基最好完全配对，而引物3’端最后5～6个核苷酸与模板的错配应尽可能少。

5. 引物3’端碱基最好是T、G、C而不是A，这样会有利于延伸。

6. 可在引物5’端添加不与模板互补的额外序列以便于后续分析。