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        转基因定量PCR检测操作步骤

        丁香园论坛

        5971

        1. 样品制备
        20-50 mg食品及标准品研磨成粉,按以下方法抽提DNA:PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent (AB, 4318930), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)

        2. SDS检测板设置
        Plate类型: Single Reporter, Real Time。
        FAM层: 未知样品、标准品、对照均设定为UNKN;不同类型的检测孔可在Sample Name栏以不同名称相互区分。命名请参照以下规则:标准品:1 Maize STD 0%;未知品:Unk #1 Soy。
        VIC层: 未知样品、标准品、对照均设定为IPC+。
        Passive Reference: ROX。
        Quencher: TAMRA。
        Replicate: 同一组重复样品给定同样的名称,如“1.0% GM Std”。

        3. PCR反应
        无论STND和UNKN,每一样品至少重复检测3次。

        试剂 用量
        DNA (10ng) 5 ul
        PCR Mix 44 ul
        Taq Gold (5 U/ul) 1 ul
        总体积 50 ul

        阴性对照和阳性对照分别以5 ul Negative Control或Positive Control代替DNA。
        PCR循环条件:94 °C 9 min ® (95 °C 20 sec ® 60 °C 1 min ® 72 °C 30 sec) x 40个循环

        4. 数据分析
        1. PCR完成后,保存数据;运行Analysis命令;Export Results,Save。也可Export Selected Wells。
        2. 在Excel中打开所输出的结果,按Replicate (first) 和Well (second) 分别Sort FAM和VIC数据
        3. 增加一列,计算DCT值(= CT FAM - CT VIC)
        4. 增加两列,分别计算DCT值的平均值和标准偏差
        5. 将标准品的%GM和平均DCT数据转移到另外一个区域,计算Log (%GM)
        6. 利用Excel的TREND运算计算各未知样品的%GM
        7. 上述计算也可以利用已有的Excel宏自动完成:在Excel Macro“Calculate %GMO”中,粘贴标准品及未知样品的FAM和VIC层的CT值,Excel Macro即自动计算出DCT值(CT FAM - CT VIC)、标准曲线和各UNKN样品的%GM。

        5. 主要试剂和器材
        1. 4327691 TaqMan GMO Soy Detection kit
        2. 4327690 TaqMan GMO Maize Detection kit
        3. 由GMO Concentration Reference Standards (Fluka) 制备的标准品DNA,包括0%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%等 6种。
        4. Microsoft Excel Spreadsheet
        5. 96-well plate 离心机

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