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        人外周血单细胞悬液制备流程及注意事项

        Elabscience

        2066

        人外周血单细胞悬液制备流程

        1. 1.采集人外周血样本于抗凝管中。
        2. 离心管内加入100 μL新鲜血和2 mL 1×红细胞裂解液,混匀,4℃裂解10 min。
        3. 300 g离心5 min(裂解完立即离心,防止时间过长损伤细胞),弃上清,得到白色细胞沉淀。
        4. PBS洗涤一次。

        加入100 μL细胞染色缓冲液重悬细胞,不用计数,即可进行后续流式抗体染色实验。按照100 μL新鲜血样本制备的单细胞悬液,加入1 Test对应的流式抗体混匀进行后续实验。人外周血单细胞悬液制备流程及注意事项人外周血单细胞悬液制备流程及注意事项

        注意事项:

        1. 采血用抗凝管,有肝素和EDTA两种。若直接裂解红细胞进行表面指标染色实验,两种抗凝管都可使用;如果是采血后检测细胞因子,则必须使用肝素抗凝。

        2. 裂解液推荐使用10× ACK Lysis Buffer(E-CK-A105),不含固定剂。

        3.10× ACK Lysis Buffer实验前需用纯水稀释成1×,现配现用,推荐放在4℃条件下暂存,当天使用。

        4. 检测人外周血中常规指标,可用过夜保存的样本,一般来说问题不大。但是对于表达量比较低的指标,建议用新鲜的样本检测。

        5. 第三步裂解完后离心弃上清时,建议用移液枪轻轻吸走残液。如果直接倒掉,离心管内会有残留裂解液,后续加入100 μL PBS重悬细胞时,可能不能完全稀释裂解液,导致红细胞裂解过度。

        6. 细胞沉淀重悬,可用枪轻轻吹打,或者用转速小的涡旋仪涡旋。

        7. 人血样本建议染CD45,有利于后续数据分析时圈门。

        8. 处理人血样本时,推荐设置只染CD45的单染管低速上机用来设置阈值,观察细胞量,圈淋巴细胞群。

        9. 人外周血中主要含T淋巴细胞,B淋巴细胞的量较少。如果使用病人的血液样本,B淋巴细胞的量可能更少,因此B淋巴细胞的检测不推荐使用过夜的样本,过夜样本易导致检测信号低。

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