外周血 PBMC 单细胞悬液制备

1）用移液器吸取 4 mL HISTOPAQUE^®-1077 到 15 mL 离心管内，室温平衡至少 15 min。

2）外周血恢复至室温后，吸取 4 mL 外周血，小心缓慢地加入到装有淋巴细胞分离液的 15 mL 离心管内，25℃，400 x g 离心 30 min。

3）小心取出离心管，此时离心管内液体分为三层，上层为血浆，中间层为分层液，底层为红细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄的白膜层）。用 1000μL 移液器吸取最上层血浆将其弃掉，不要碰到单个核细胞层。

4）将 1000μL 移液器插入白膜层，沿离心管壁小心吸取单核细胞至一个新的 15 mL 离心管内。

5）加入 10 mL 含 2% 胎牛血清（FBS）1 x PBS 到步骤 4）的 15 mL 离心管内，用移液器温和的将其混匀。

6）4℃，250 g 离心 10 min。

7）弃掉上清，向离心管底部的细胞沉淀中加入 1 mL 稀释到 1 倍的红细胞裂解液，轻柔吹吸混匀，在冰上裂解 2-3 min。

8）加入 9 mL 含 2% FBS 的 1 x PBS，温和混匀，终止裂解。

9）4℃，250 g 离心 10 min。

10）弃掉上清，用 10 mL 含 2% FBS 的 1 x PBS 重悬细胞，轻柔吹吸混匀。

11）4℃，250 g 离心 10 min。

12）弃掉上清，用 1 mL 90% FBS+10% DMSO 重悬细胞。置于程序降温盒内，于-80℃ 冰箱冻存，第二天至于干冰内邮寄到百奥智汇，干冰需充足。

1）外周血应用 EDTA 抗凝管收取。

2）请确认离心机可以进行密度梯度离心。

3）开始实验前要把外周血和淋巴细胞分离液室温平衡至少 15 min，否则会导致分层不明显，影响实验结果。

4）将全血加入到装有淋巴细胞分离液的离心管中时，注意要将离心管倾斜 45 度，一定要缓慢加入，否则会影响梯度离心。

5）弃掉上层血浆时应注意不要碰到单个细胞层；吸取单个细胞层时注意不要吸取到下面的红细胞层。

6）红细胞裂解时应注意时间，避免裂过。

7）全程操作注意均要温和操作，保持细胞活性。

8）程序降温盒使用前应提前放置在室温。