酶切、回收、连接 常识

 

三．填空题

 

 

1 ．限制酶是一类专门切割 DNA 的酶，它能特异性识别切割 双 链（单、双）DNA 。

 

2 ．II 型限制酶识别位点一般长度为 4~6 个核苷酸对。

 

3 ．个体之间DNA 限制酶片段长度存在差异称 限制性片段长度多态性（ RFLP ）。

 

4 ．限制酶命名采用Smith 和A thens 提议的方案，第一个字母大写取自来源细菌的 属名 ；第二、三个字母取自来源细菌的 种名 ；第四个字母（如果有）取自来源菌的 株系 。

 

5 ．需要部分酶切时可采取的方法有（1 ）减少酶的用量 （2 ）缩短反应时间 （3 ）增大反应体积 。

 

6 ．限制酶识别序列为n 个碱基，则其切割频率的理论值应是 4ⁿ 。

 

7 ．限制性内切酶通常保存在 50% 浓度的甘油溶液中。

 

8 ．甘油浓度是导致一些酶的星活性的原因之一，在酶切时反应体系中的甘油浓度应控制在 5% 以下。

 

9 ．限制与修饰是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA 的 限制 和对自身DNA 的 修饰 来实现的。

 

10 ．II 型限制酶既具有 识别位点 的专一性，也具有 切割位点 的专一性。它作用时需要 Mg²⁺ 离子作辅助因子。

 

 

 

四．简答题

 

1 ．在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA ）的目的与机理是什么？

 

答：目的是保护酶的活性；机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活。

 

2 ．如果用EcoR I 酶切DNA 时出现星活性，试分析原因？

 

答：主要原因有：酶浓度太高；高PH ；低盐；含Mn²⁺ 、Cu²⁺ 等非Mg²⁺ 金属离子；甘油浓度高于5% ；存在某些有机溶剂。

 

3 ．下列序列中哪些可能是II 类限制酶的识别序列？

 

ATATCG CCCGGG GATATC AGCCGA GAGTC

 

答：CCCGGG GATATC GAGTC

 

4 ．用Klenow 酶可将5 ‘粘末端填补成平末端，而导致某些限制位点消失，下列酶切后用klenow 处理再连接不会丢失识别位点的是哪些？

 

XmaI C ↓CCGGG BssH II G ↓CGCGC PstI CTGCA ↓G

 

HhaI GCG ↓C HpaII G ↓CGC

 

答：BssH II, HpaII

 

5 ．当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？为什么？

 

答：要避免星活性及部分酶切。（1 ）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2 ）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA 重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3 ）先低温酶，后高温酶；（4 ）使用通用缓冲液。

 

6 ．试计算下列三种限制酶各自在某染色体DNA 序列上的切割概率

 

Sau3A I GATC Pst I CTGCAG Hinf I GANTC

 

Acy I GPuCGPyC

 

答： 1/4⁴ ；1/4⁶ ；1/4⁴ ；（1/4⁴ ）x(1/2² )

 

7 ．一长为4.2kb 的DNA 片段，分别用EcoRI 、PstI 及EcoRI+PstI 消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱

 

<rect> <rect> <rect> <font><font> </font> </font> </rect></rect></rect>

 

 

 

0.7kb

 

0.7kb 0.8kb

 

1.5kb 1.4kb 2.0kb

 

2.0kb 2.8kb

 

 

 

 

 

EcoRI Pst I EcoRI + Pst I

 

答： EcoRI PstI EcoRI

 

_{0.7kb 0.7kb 0.8kb 2.0kb}