DNA的重组连接实验原理和详细步骤

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DNA的重组 连接实验原理和步骤

发布: 2010-03-29 来自: 易生物实验

一、实验目的

用T4DNA连接酶将载体pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段连接起来，构建体外重组 DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。

二、实验原理

重组 的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。

(一)DNA连接 酶的作用步骤

1.T4DNA连接 酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物(腺苷酰酶)

2.酶-AMP复合物再结合到具有5´-磷酸基和3´-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

3.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。

(二)DNA的连接方式

在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。

连接的方式有：

1.自连

2.两种片段相连

3.三个片段以上的自连与互连

(三)连接反应的条件

1.缓冲液：一般商品酶都带有10倍的缓冲液，有Mg2+、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT(二硫苏糖醇)以防止酶的活性基因氧化失活。BSA(小牛血清蛋白)维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。

2.温度：连接反应温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，EcoR Ⅰ酶所产生的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，为12～16℃。

3.时间：12～16℃ 12～16小时(过夜);或7～8℃ 2～3天。

三.实验材料

1.pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理DNA片段。

2.5.4Kb含有Str的EcoR Ⅰ回收DNA片段。

3.T4DNA连接酶

四.实验仪器、器皿及试剂

仪器、器皿(见附录)

试剂：10×T4DNA连接酶缓冲液

660mmol/L Tris-HCl(pH7.5)

50 mmol/L MgCl2

50 mmol/L DDT

50 mmol/L ATP

五.实验步骤

1.取3只Eppendorf管，一管做重组连接，一管做pBR322未经CIP处理的自连，另一管做pBR322经CIP处理的自连。

2.用微量进样器按下表分别取样各溶液于Eppendorf管中。

DNA酶切反应物

10×T4连接缓冲液

ddH2O

T4DNA连接酶

总体积

pBR322 EcoRⅠ-CIP

5μl(100ng)

5.4Kb EcoR Ⅰ片段

5μl(约400ng)

2μl

7μl

1μl

20μl

pBR322 EcoRⅠ-CIP

3μl(60ng)

2μl

14μl

1μl

20μl

pBR322 EcoRⅠ

3μl(60ng)

2μl

14μl

1μl

20μl

加样顺序为ddH2O，10×T4缓冲液，DNA片段，最后加T4DNA连接酶(放于冰浴中)连接酶取好后应立即放回-20℃保存。

3.盖紧盖子用手指弹匀Eppendorf管，于台式离心机上转2秒钟，以集中样品。

4.将3管连接样品放入温度12℃恒温水浴锅中，过夜。

5.第二天上午各管取约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时要加入pBR322 EcoR Ⅰ酶切片段作电泳对照。