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        【共享】DNA重组

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        2688
        DNA的重组
        T载体连接(T/A cloning)
        (一)、试剂:
        a.  外源片段DNA;
        b.  pGEM®-T easy 载体或pMD18-T 载体。

        (二)、流程:
        a.  将pGEM®-T easy或pMD18-T离心至管底。
        b.  建立以下连接体系(每次使用前切记将2×Buffer振荡混匀):
        表格 14、pGEM®-T easy连接体系
        成份  10µl体系  20µl体系
        2×Rapid Ligation buffer
        最好按照每次用量分装,避免多次冻融。  5µl  10µl
        pGEM®-T  1µl  1µl
        PCR 产物(含有粘性A末端)  3µl(Maximum)  8µl(Maximum)
        T4 DNA Ligase(3 Weiss units/µl)  1µl  1µl
        用Tip吹打混匀,室温×1h或4℃过夜
        表格 15、pMD18-T连接体系
        成份  10µl体系  20µl体系
        2×Ligation solution I (内含buffer和连接酶)
        应该按照每次用量分装,避免多次冻融。  5µl  10µl
        pMD18-T  1µl  1µl
        PCR 产物(含有粘性A末端)  4µl(Maximum)  9µl(Maximum)
        用吸头吹打混匀,室温×1h或4℃过夜

        说明:
        A、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求:
        表格 16、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求
        PCR产物大小  反应体系最低含量要求  每µl含量
        0.5kb  125ng  8.5ng~41.5ng
        1kb  250ng  17ng~83ng
        2kb  500ng  34ng~166ng
        B、平端PCR产物加尾体系(for efficient T/A cloning):
        表格 17、平端PCR产物加尾体系
        成份  加入量  实用量参考
        纯化的无A末端的PCR产物  1~7µl  7µl
        Taq DNA Polymerase 10×
        Reaction Buffer with MgCl2  1µl  1µl
        dATP  终浓度0.2mM  终浓度0.2mM
        Taq DNA Polymerase  5units  1µl(Takara产品)
        去离子水  调整体积10µl  调整体积10µl
        反应:70℃×15~30min    此步后可电泳回收,
        用10µl水溶解离心,
        吸取3µl(10µl体系)
        或者8µl(20µl体系)
        进行连接反应
        吸取1~2µl和T载体
        建立连接反应    可将10µl全部
        用于连接反应

        c.  准备转化JM109等宿主细胞,蓝白斑筛选。

        粘端连接法
        ㈠试剂及材料:
        1、 含目的基因片段的DNA。
        2、 载体DNA。
        3、 10×Buffer 通用buffer:
        4、 限制性内切酶1和限制性内切酶2。
        5、 去离子双蒸水。
        6、 10×连接buffer
        7、 T4 DNA Ligase(连接酶)

        ㈡操作程序:
        1、制备目的基因片段和目的线性化载体:建立如下酶切反应2个,分别酶切目的基因和载体
        表格 18、双酶切反应体系
        成份  10µl体系  20µl体系
        质粒DNA(+水或TE)  8µl  16µl
        10×Buffer (通用Buffer)  1µl  2µl
        限制酶1  0.5µl  1µl
        限制酶2  0.5µl  1µl
        总体积  10µl  20µl
        注意:双酶切通用Buffer可以查阅试剂目录确认。
        2、琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段和线性化载体(见相关实验流程)。
        3、在1.5ml Eppendorf管中建立连接反应:
        表格 19 粘端连接反应
        成份  10µl体系  20µl体系
        目的基因片段  6µundefined  13µundefined
        线性化载体  2µundefined  4µundefined
        10×连接Buffer  1µl  2µl
        T4DNA连接酶  1µl  1µl
        去离子双蒸水至总体积  10µl  20µl
        16℃×12~16h 或 4℃×过夜
        注意:标记有的剂量仅是示意,实际使用中以2片段中的短片段(一般为目的基因片段)与长片段(一般为线性化载体)的摩尔比为2~10:1为好。
        4、将连接的重组质粒转化大肠杆菌,根据不同用途选择不同菌种制备感受态细胞(见相关实验流程)。
        平-粘端连接法(定向连接反应)
        ㈠试剂及材料
        1、 含目的基因片段的DNA;
        2、 载体DNA;
        3、 限制性内切酶;
        4、 T4 DNA连接酶;
        5、 Klenow大片段;
        6、 2mM dNTP;
        7、 10×Klenow buffer。

        ㈡操作程序
        1、 制备目的基因片段和线性载体:
        将载体双酶切后,琼脂糖凝胶电泳回收,使其两端位点不同,防止连接时自身环化。
        将含目的基因片段的DNA双酶切,其中必需只有一种与载体酶切所有的酶相同;琼脂糖凝胶电泳回收。
        2、 粘端连接:
        目的基因片段和载体各有一匹配末端,先用T4 DNA连接酶作用12h,将其连接起来。
        而另一端不匹配,无法连接。此时即形成载体连接有目的基因的开环结构。
        3、 Klenow补平反应,将带有目的基因载体两端的粘性末端补平:
        表格 20、Klenow补平反应体系
        带目的基因的载体(0.1µg)  4µl
        10×Klenow buffer  2µl
        Klenow大片段  1µl
        2mM dNTP  2µl
        去离子双蒸水至总体积  20µl
        室温2h后,酚、氯仿抽提,乙醇沉淀。
        溶于10µl TE(pH8.0)。
        4、平端连接:
        再用T4DNA连接酶作用16~20h,使带有目的基因片段的载体环化。
        5、将重组质粒转化感受态细胞。
        6、克隆筛选鉴定重组质粒。
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