RNAi技术路线选择及应用

近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。现在越来越多的研究人员开始采用RNAi来研究生物体的基因表达。RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
RNAi研究的一般技术路线是：

由上述的路线可以看出，获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步，而转染的效率则是非常关键的因素。

一、siRNA的设计
　　在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3‘端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

选择siRNA靶位点：
　　从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5"和3"端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

序列同源性分析:
　　将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。
通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。

设计阴性对照：
　　一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。

此外网上提供免费的siRNA设计工具www.qiagen.com/siRNA, http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/