• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        镜像方向选择实验

        相关实验:镜像方向选择实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        第 1 阶段:用于 MOS 和 XmaⅠ消化的 PCR 扩增

        一、材料


        1. 缓冲液、溶液和试剂

        EDTA,0.2mol/L

        矿物油

        TN 缓冲液(10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10mmol/LNaCl)

        2. 酶和酶缓冲液

        PCR 缓冲液,10X(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁,10mmol/L 乙酸钾,75 mg/mlBSA,或者厂商提供)

        聚合酶混合液,50X(Advantage2,Clontech,或相当产品)

        XmaⅠ(10U/ul)

        XmaⅠ缓冲液,10X

        3. 核酸和寡核苷酸

        DNA

        dNTP 溶液(包含所有 4 种 dNTP,各 10 mmol/L)

        各稀释的第二次杂交样品(来自方案 2 第 17 步)

        PCR 引物 P1

        PCR 引物 NP2R

        PCR 引物 P1

        4. 专用设备

        热循环仪

        水浴,预设为 37°C 和 74°C

        5. 附加试剂

        琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

        酚:氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂

        二、方法

        1. 用于 MOS 的初级 PCR 扩增

        (1) 从每个稀释的第二次杂交产物中(来自方案 2 第 17 步)各取 10ul,加到标记好的管子中。

        (2) 按照下表,配制用于初级 PCR-1 的主体混合液。这个配方足够做一个反应。根据要按比例扩大。对于每个反应,按照下表将试剂混合。

        镜像方向选择实验

        (3) 混匀,并短暂离心。

        (4) 将 115ul 主体混合液分装到第 1 步的反应管中。

        (5) 将最终的 125ul 混合液,分装到 5 个 0.5 ml(原文为 ul—译者改)的 PCR 管中(每管 25ul)。

        (6) 用 1 滴矿物油覆盖。

        (7) 将反应混合液在热循环仪中 74°C 温育 5 min,以延伸接头,然后立即开始以下循环。

        镜像方向选择实验

        (8) 从 5 个初级 PCR-1 产物中,各取 2ul 到一个管中混合,并加 390ulH20。

        (9) 从第 8 步稀释的每个初级 PCR-1 产物混合液中,各取 1ul 到一个标记妤的 PC 管中。

        (10) 按照下表,配制用于初级 PCR-2 的主体混合液。

        镜像方向选择实验

        (11) 混勻,并短暂离心。

        (12) 将 24ul 主体混合液分装到第 9 步的各反应管中。

        (13) 用 1 滴矿物油覆盖。

        (14) 立即开始以下循环。

        镜像方向选择实验

        (15) 从每个反应产物中,各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。

        2. 用于 MOS 的次级 PCR

        (16) 从上面第 14 步产生的每个初级 PCR-2 混合液中,各取 2ul, 用 38ulH20 稀释。

        (17) 从每个稀释的初级 PCR-2 产物混合液中,各取 2ul,分装到标记好的管子中。

        (18) 按照下表,配制用于次级 PCR 的主体混合液。这个配方足够做一个反应,根据需要按比例扩大。对于每个反应,按照下表将试剂混合。

        镜像方向选择实验

        (19) 混匀,并短暂离心。

        (20) 将 48ul 主体混合液分装到第 2 步的反应管中。

        (21) 用 1 滴矿物油覆盖。

        (22) 立即开始进行 10~12 个循环:95°C 10s,68°C10s,72°C1.5 mm。

        (23) 从每个反应产物中各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。

        (24) 用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化次级 PCR 产物。

        (25) 用 20~40ulTN 缓冲液溶解沉淀,使 DNA 浓度为 20ng/ul

        (26) 取 2ul 纯化的 PCR 产物,在 2.0% 琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析。

        (27) 用 1.6 mlH20 稀释 14 第 10 步纯化的 PCR 产物(这将作为未消化的对照)。

        (28) 反应产物保存在-20°C。

        3.XmaI 消化

        (29) 在管中加入下列试剂

        镜像方向选择实验

        (30) 混匀,然后在 37°C 温育 2 h。

        (31) 加入 2ul 0.2mol/LEDTA,以终止反应。

        (32)74°C 温育 5 min, 使酶失活。

        (33)-20°C 保存。

        第 2 阶段:MOS 杂交

        一、材料


        1. 缓冲液、溶液和试剂

        稀释缓冲液(20 mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50 mmol/LNaCl 和 0.2 mmol/LEDTA)

        4X 杂交缓冲储存液:4mol/LNaCl,200 mmol/LHEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷

        基三乙基溴化铵(CTAB),最终的 1X 杂交混合液用稀释缓冲液来稀释矿物油

        2. 核酸和寡核苷酸

        XmaI 消化的 DNA

        3. 专用设备

        热循环仪

        二、方法

        1. 在一个 1.5 ml 的离心管中,混合以下试剂。

        镜像方向选择实验

        2. 从混合液中,取 2ul 到一个 0.5 ml 的离心管中,用 1 滴矿物油覆盖。

        3. 在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

        4. 在热循环仪中 68°C 温育 3 h。

        5. 在管中加 200ul 稀释缓冲液,并吹吸混匀。

        6. 在热循环仪中 70°C 加热 7 min。

        7.-20°C 保存。

        第 3 阶段:MOSPCR 扩增

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        dNTP 溶液(包含所有 4 种 dNTP, 每种为 lOmmol/L)

        矿物油

        2. 酶和酶缓冲液

        PCR 缓冲液,lOX(4Ommol/L Tricine KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁,10 mmol/L 乙酸钾,75 mg/mlBSA, 或者厂商提供)

        聚合酶混合液,50X(Advantage2,Clontech, 或相当产品)

        3. 核酸和寡核苷酸

        稀释的 DNA 样品(杂交后的样品及相应的未消化对照,方案 4 第 2 阶段第 6 步和方案 4 第 1 阶段第 26 步)

        MOSPCR 引物(NP2Rs)

        4. 专用设备

        热循环仪

        5. 附加试剂

        琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

        二、方法

        1.按照下表,为所有的 MOSPCR 配制主体混合液。

        镜像方向选择实验

        2.在标记好的含有 24ul 主体混合液的管子中,各加 lul 稀释的 DNA 样品(杂交后样品及相应的未消化对照)。

        3.用 1 滴矿物油覆盖。

        4.将反应混合液放在热循环仪中,74°C 温育 5 min, 以延伸接头(不要将样品从热循环仪中取出)。

        5.立即开始下面的循环。

        6.从每个管中,各取 4ul 在琼脂糖凝胶上分析。

        7.反应产物保存在-20°C。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序