[原创]CDNA第一条链的合成 （20微升体系）

CDNA第一条链的合成 （20微升体系）
一、  按以下顺序加样于500微升EP管中
1. RNA 5 UL
2. Oligo Dt 1 UL
3. dNTP 1 UL (浓度10mM)
4. DEPC水 5UL (为试剂盒中配套的水)
共12UL混匀离心——70℃水浴5分钟——冰浴2分钟（片刻）
二、  继续按以下顺序加样
1. 5×BUFFER 4 UL
2. 0.1MDTT 2UL
3. RNase Ouundefined 1UL
混匀——37℃ 2分钟
三、再加M-MLundefined 1 UL
共20UL 混匀37 60分钟——70℃ 15分钟
四、CDNA 合成完毕，4℃冰箱保存
“”标识为反应酶，需现用现取，千万不要长时间常温放置，防止酶失活
五、普通RT-PCR 反应
PCR反应体系确定标准：
Mg2+ 1.5 mmol/L
Kcl 50 mmol/L
dNTPs 200umol/L
引物 1 umol/L
DNA聚合酶 1-5unit
模版DNA 1pg--1ug
1目的：验证引物的正确性，为实时定量PCR做准备；若目的基因条带清楚，无杂带，可进一步制作目的基因标准曲线
2准备工作：根据引物不同，确定不同的反应体系，做好标记
3现以本人目的基因为例说明如下：
ETS、HGF、CMET、内参GAPDH
每一份CDNA样品需分4管( PCR仪专用EP管)
⑴ ETS_1
⑵ HGF
⑶ CMET
⑷ GAPDH
每一反应体系需按下列体积加样
模版CDNA 2UL
10×Buffer 2UL
dNTP 2UL（浓度2.5mM）
引物上游 1UL
引物下游 1UL
Tap酶 1UL （该酶浓度 15u/ul）
DEPC水 11UL
共20UL反应体系
如需配制4个反应体系，先把公用部分按4倍加入500UL EP管中，再分装为4管
DEPC水 11UL × 4 == 44
模版CDNA 2UL × 4 == 8
10×Buffer 2UL × 4 == 8
dNTP 2UL× 4 == 8
共68UL，分装为4管，每管17UL


六、琼脂糖普通凝胶电泳，验证PCR反应效果
1.配制琼脂糖普通凝胶（1.5%）
琼脂糖 0.45g
1×TBE 30ml
微波炉中火加热约1分钟，至琼脂糖TBE混合液变清澈即可
待稍微冷却后加入
EB染料 1.5ul（事先配制好染料）
将配好的琼脂糖倒入电泳槽内，冷却30分钟待用
2.加样
Loading Buffer为6倍缓冲液
再取4个50UL EP管，分别做好标记
每管中加入1UL PCR扩增产物，5UL 6×Loading Buffer缓冲液，离心混匀待用
MARKER ： DL 2000
3.电泳约30-40分钟
4.紫外灯下观察，若条带清晰，位置正确，即可进入DNA回收阶段