【求助】microRNA荧光定量反转录问题
丁香园论坛
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我要做microRNA成熟体的荧光定量，内参为U6，现在有一个问题很纠结：我在做反转录时候，因为要做特异性的反转录，请问内参和小NRA是放在一个管子里，在同一个体系里面一起反转录出来，还是要将内参和小RNA分别反转录，如果一起反转录出来，反转录体系要怎样加呢，反转录过程中会不会有竞争！
谢谢，急待回答！！！！
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是在同一个管子里逆转录的，这样才能保证总RNA是一致的。因为引物序列不一样，结合的模板也是不同的。另外按照说明书的体系，酶一般是过量的。
是要加在同一个管子里进行反转的，我这里有个体系楼主可以试试，希望能够帮到你
RNA sample 3ug（根据浓度确定体积）
oligoT18 3uL
miR引物 1.5uL(若多个引物就依次加入并减少水量)
U6引物 1.5uL
加水至19uL
42度，5min；冰浴3min。
undefinedBuffer 6uL
RNAase inhibitor 1uL
dNTP 3uL
M-MLV 1uL
42度2小时，80度灭活10分钟。
RNA sample 3ug（根据浓度确定体积）
oligoT18 3uL
miR引物 1.5uL(若多个引物就依次加入并减少水量)
U6引物 1.5uL
加水至19uL
42度，5min；冰浴3min。
undefinedBuffer 6uL
RNAase inhibitor 1uL
dNTP 3uL
M-MLV 1uL
42度2小时，80度灭活10分钟。
我分开反转录了。那这样是不是实验就没有意义啊？
是不是得重新将目的基因的特异引物和U6放入一管啊？
我的试剂盒上是说引物要3ul，那是不是特异引物和u6各加1.5ul呢？
是不是得重新将目的基因的特异引物和U6放入一管啊？
我的试剂盒上是说引物要3ul，那是不是特异引物和u6各加1.5ul呢？
应该是要加在一个管子里反转录的。 内参的设置主要是为了校正上样量的差异，保证基因在同一起跑线上比较。如果能保证加样量一致，两种方法没有实质区别。一般基因mRNA检测时一个反转录就可以检测所有mRNA基因，因此反转录是在同一管进行。由于miRNA自身短小的特点，每个miRNA均需用特异的反转录引物进行反转录，这些反转录引物如果不能混在一起，则内参的反转录也分开进行。
如果不同的miRNA进行反转录，引物之间的混合有可能导致引物二聚体的产生及非特异的扩增，因此引物混合前要做预实验比较混合前后对miRNA定量检测的影响，如果证明混合后没有影响才能混合使用，建议每个miRNA还是分开反转录和定量PCR。
如果不同的miRNA进行反转录，引物之间的混合有可能导致引物二聚体的产生及非特异的扩增，因此引物混合前要做预实验比较混合前后对miRNA定量检测的影响，如果证明混合后没有影响才能混合使用，建议每个miRNA还是分开反转录和定量PCR。
keathy0505 wrote:
是要加在同一个管子里进行反转的，我这里有个体系楼主可以试试，希望能够帮到你
RNA sample 3ug（根据浓度确定体积）
oligoT18 3uL
miR引物 1.5uL(若多个引物就依次加入并减少水量)
U6引物 1.5uL
加水至19uL
42度，5min；冰浴3min。
undefinedBuffer 6uL
RNAase inhibitor 1uL
dNTP 3uL
M-MLV 1uL
42度2小时，80度灭活10分钟。
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