请教用加尾法进行microrna的反转录和qpcr
素年年
U6内参的扩增曲线和熔解曲线都很好，但一测miR就是都不行，扩增曲线出现平台期下降，熔解曲线单峰的情况很少，几乎都是双峰或宽峰，即使少数较尖锐的单峰熔解温度也很低，75-76度左右。
有必要做NRC吗？之前做了几组NTC发现存在引物二聚体的情况，但miR的上游引物基本就是全序列了，cDNA已经稀释到100倍了，引物10μM从0.6μL降到0.4μL了，提高退火温度基本没有改善，不知道还能怎么优化了，请教一下大家
2 个回答
从头酷到矫
你好.可以分享一下u6的引物序列嘛
loveliufudan
首先，您提到进行了负模板对照（NTC），发现存在引物二聚体的情况。这可能会导致假阳性的信号。您已经尝试稀释cDNA和调整引物浓度，但没有看到改善。这种情况下，考虑使用非反转录控制（NRC）来评估反转录过程中的污染情况，以确定是否存在其他因素导致结果不准确。
此外，您可以尝试以下优化步骤：
1. 确保您的实验条件和PCR反应体系是正确的，包括反应缓冲液、酶的浓度、模板量等。参考相关文献或厂家推荐的实验方案进行操作。
2. 检查反应温度和退火温度的优化，可能需要尝试不同的温度梯度。
3. 检查引物的设计和序列，确保引物与目标microRNA的互补性良好，并且没有二聚体倾向。
4. 考虑尝试其他反转录和扩增方法，例如使用不同的反转录酶或qPCR引物。
素年年
请问怎么检查引物和microrna的序列是否特异啊 因为上游引物基本就是microrna的全序列了T T
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