EnzymoPure™ M-MuLV反转录酶，EnzymoP

产品介绍：

EnzymoPure™M-MuLV反转录酶(RTM-MuLVReverse Transcriptase)是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶。和普通的M-MuLV反转录酶相同，RTM-MuLV反转录酶也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；同时具有RibonucleaseH(RNaseH)酶活性，可以选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，但不剪切单链RNA或双链RNA。

特点：

M-MuLV反转录酶可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶仅能合成长达9kb的cDNA；M-MuLV反转录酶的最适反应温度为42℃并且在50℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶在37℃反应时的一些不足。

用途：

M-MuLV反转录酶常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。M-MuLV反转录酶合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-timePCR、cDNA第二条链的合成等。M-MuLV反转录酶也可以用于DNA探针的标记，以及通过引物延伸(primerextention)来分析RNA。

来源：

M-MuLV反转录酶由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码MoloneyMurineLeukemiaVirusreversetranscriptase的pol基因片段。

酶储存溶液：

50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。Reaction Buffer(5X)：250 mM Tris, pH 8.3 at 25℃, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT。

失活或抑制：

70℃孵育10分钟可以导致M-MuLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对M-MuLV反转录酶有抑制作用。本产品用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。

注意事项：

对于GC含量比较高的RNA的反转录，试剂盒的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

1.cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesi)：a.参考如下表格设置反转录反应：模板(后面3种任选一种)Total RNA0.1-5μg或Poly(A) RNA/mRNA10-500ng或Specific RNA0.01pg-500ng引物(后面3种任选一种)Oligo(dT)18 0.5μg (或100pmol)random hexamer0.2μg (或100pmol)Gene specific primer15-25pmolDEPC-treated Water－To 13.7μl*Reaction Buffer (5X)－4μlRNase Inhibitor－0.5μl**dNTP Mix (25 mM each)－0.8μl ***RT M-MuLV反转录酶－1μl总体积20μl*To13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应， 加入DEPC-treated Water混匀后微离心，接着可以在65℃孵育5分钟，随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。RNaseInhibitor可以视其本身的情况加入适当的量，例如0.5μl或其他适当体积。在加入其他体积时，DEPC-treated Water的用量需适当调整。dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。b.轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。c.如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用randomhexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。d.70℃孵育10分钟以失活RT M-MuLV反转录酶并终止反转录反应。说明：对于长片段的cDNA不推荐采用加热的方法失活RT M-MuLV反转录酶，这种操作可能会导致部分长片段DNA被剪切。e.反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为50微升，则推荐使用2微升反转录产物。2.其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶的相关文献资料进行。常见问题：1.总RNA反转录产物电泳观察不到。反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。2.反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。