【原创】引物设计大半年经验参考

适用条件：RT-qPCR荧光定量。
常用软件或网站：NCBI在线引物设计，IDT在线引物设计，sigma在线引物设计、primer3在线引物设计、primeprimer 5.0。

根据我最近大半年来设计了无数对引物的经验来看，我想说的是，以上任何一种方法设计的引物几乎均可在一个较低的退火温度（例如52℃退火的三步法）下实现PCR扩增，只不过是扩增效率以及溶解曲线好与不好的差别。

与其每次设计几个基因如果都从52℃开始摸索，且可能每种基因的最适条件并不一，还不如寻找一个能在60℃（taq酶的5’外切酶活性在60度最强）能较为统一地有效的PCR扩增工具，岂不省去多个基因的摸索，且大量减少了分批上样的工作量。

那么，哪个工具几乎每次都可以使设计的各个引物基本都可以在60℃高效率扩增呢？

答案是，NCBI在线引物设计（也就是NCBI blast的那个页面）。

起初我很是不相信NCBI设计的引物的（2009年开始有设计引物功能的好像是），因他历史短啊，呵呵。也知道大部分战友用的是prime primer 5.0或primer3，但我还是在阴差阳错地发现了NCBI的厉害。

鉴于坛子里关于NCBI在线引物的帖子少之又少，或者说也有大神用过N多工具设计过引物只不过没有分享到坛子里的情况，所以今天才斗胆发个帖子出来与各位伙伴共享，同时与各位战友共同探讨。

同时，贴出NCBI引物设计的具体步骤：
1. 加载目的基因的FASTA格式文件
2. qPCR指定PCR product size为70-150bp
3. 选定Organism为目的物种
4. Get primer
5. 最好从结果中选择为跨内含子的引物序列即可，若结果中没有跨内含子的引物，则关闭页面重新设计，步骤变为：

1. 加载目的基因的FASTA格式文件
2. qPCR指定PCR product size为70-150bp
3. 勾选下图所示，并适当调整intronlength的MIN值，例如100、500、1000。
4. 选定Organism为目的物种
5. Get primer
6. 从结果中选择特异性强的引物，其次选择靠近3‘端的引物

以上体会经历均是本人做了大量PCR工作的切身感受，仅供参考，与各位战友共享~