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        用LIPO2000转染HepG2细胞的问题

        互联网

        9880

        乡乡问:

        最近本人在做HepG2细胞的转染,转染的是GFP质粒,按照LIPO2000的说明书使用后,发现细胞的死亡很严重,24h时差不多死了一半。而且我在转染前细胞密度差不多达到90%,也在转染后6小时的时候换了培养基。在显微镜下看荧光的转染效率大概有70%-80%,虽然效率还可以,但是由于细胞死亡对我后续的实验有影响,所以在此请教各位高手,如何才能使细胞不死,或有说明实验室对于HepG2的转染有比较好的条件的,敬请各位不吝赐教!谢谢!

        花面交相映认为:

        Invitrogen 的Lipofect2000细胞毒性的确较大,我们实验室也经常用此来转染HEPG2细胞,我做过实验对比,转染后换液与不换液的效果差不多,不知你用的是几孔板还是皿,我们一般12孔板用质粒1.6μg,LIPO20003.2μl,脂质体复合物与细胞作用的时间不宜过长,及时补足含血清的培基,其他可能的原因有:

        1.细胞状态要好,如果细胞状态不好对转染结果会有很大影响;

        2.转染前后不要加入抗生素;

        3.所使用的试剂如转染试剂、培基、血清是否有质量保证,或是是否在保质期内;

        4.如果转染前用了无血清培养使细胞同步化,因为无血清培养对细胞损伤大,所以如果不是必要可使用无抗生素的新鲜培基培养,使细胞达到最佳状态;

        5.转染使用的质粒是否纯化或经去内毒素处理,内毒素的存在对细胞损伤大;

        6.质粒的提取要尽量在无菌环境下进行;

        7.排除其他因素后,重新摸转染条件,使用转染效率最高而死亡率最低的条件。

        祝实验顺利!

        乡乡反馈:

        谢谢花面交相映的回答。我用皿和12孔板都做过,12孔板和你唯一的不同就是我用了4微升的LIPO,你用3.2微升会比4微升好很多吗?你大概几个小时后换液?

        花面交相映认为:

        3.2和4UL应该没有太大的区别,因为我在摸条件的时候用过3.9UL,我一般不刻意换液,稳转时24-48小时之间稀释传代,瞬转时48小时后收细胞,细胞都会长的满满的,我在50%-100%的密度下都做过。

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