免疫组织（细胞）化学与定量分析（2）

没有图像分析仪可否进行图像分析？

当没有图像分析仪时，研究者早已想到用网格来进行图像分析，也获得了客观的评定结果。网格可分为两大类：一类是置于目镜内的网格，可测量切片标本上的各种数据；另一类是大的网格，可放在照片上，光镜电镜照片均可用，对照片上的各种结构可进行测量。以上二者至今仍被采用。英国标线片公司提供许多型号的市售标线片（即网格）。有的国家制造的显微镜，将目镜与带有六种不同型号标线片的旋转盘装在一起，以便于观察者作各种测量。国内某些单位有自制标线片，并有少量出售。

Aalto等1982年曾在“免疫组织化学的形态测量法一卵巢肿瘤内的胚性癌抗原”一文中推荐用视野评分法，他用三种方法对PAP法免疫组化标本进行分析：①对全切片的染色进行分级。②在10×10放大倍数下，每一切片用目镜网格任选25个方形视场进行观察，并对每一视场进行分级。③在25个视场内取25个点的着色强度进行分级。染色强度分为0级、1级（轻度）、2级（中度）、3级（重度）。方法①的结果不同于②③，而方法②和③差别不大，说明主观估算的鉴别能力低，一般镜下观察不能确切反映染色强度。

用网格进行图像分析的方法很多，如用免疫荧光等方法显示神经纤维，要表示各处的纤维密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用网格法就要客观一些，在目镜或照片上放上网格，观察阳性神经纤维与网格上的线条的交叉次数，排列密集的区域交叉次数必然多些，这就比较客观，重复性也较好。

用荧光显微镜观察免疫荧光标本，Ploem曾在1977年指出荧光强度之差至少要二倍才能在直观估计时显示出差别，说明人视觉对荧光强度变化不够敏感。作者在工作中体会到，可利用照相的自动曝光系统来作相对定量，因为荧光愈强则自动曝光时间愈短，荧光弱则自动曝光时间长，相当敏感，用眼睛观察二个荧光强度几乎无差别的细胞，也能在自动曝光时间上显示出差别来。

作者曾经将许多荧光标本用相同的曝光时间拍在同一个胶卷中，冲洗后，荧光强的区域胶卷上显色深，荧光弱的区域胶卷上显色浅，因为荧光容易淬灭，用此法可将胶卷较长期保存，而且胶卷上的信息还可通过图像分析仪测灰度等数据。这些都是在实践中的一点经验，供读者参考。

用网格测量的具体操作举例：一关联方测格，由于测点、测线、测面之间有互相关联的关系，故称为关联方测格。方格直线交叉称为测点，总数为100个，方格中所有直线称为测线，小方格边长为d如图中所示，测线总长度为200d，整个大方格为测面，测面总面积为100d2，测格周围的虚线不是测线。关联测格的优点是：只在计数位于欲测图像中的测点数P，就可计算位于该图像中的测线长度L及测面的面积A。计算方法为：L=2d·P，A=d2·P。

可摄制于小的透明胶片上，剪成你所用的目镜筒的内径大小，将其置于目镜内，使测格清晰地叠映组织标本的图像上，则可进行测量。d的长度可用台微尺来确定。也可复印在较大的透明胶片上，可用来测量电镜照片或光镜照片，将透明胶片叠加在照片上即可进行测量。某一测量的例子：

此关联方测格共有测点100个（如果只计数粗测点则有25个），图像为一个肾小体的轮廓，包括血管球和肾小囊腔，测点计数的结果，在肾小囊腔内的测点数为12，在血管球内的测点为49个，整个肾小体内的测点为12+49=61个，用台微尺测出d的长度，则可得到此图像中肾小囊腔的面积，血管球的面积，肾小体的面积。明小囊腔与肾小体的面积比12：61=19.7%等多个参数。

值得提出的是，在显微镜下网格的线条有一定宽度，如图9-6所示。计数测点时如①箭头所示，即横线上缘与竖线右缘交点处为真正的测点，若此点落在图像外面则不能计数。

表面积密度的测定：免疫细胞化学电镜照片中的膜性结构如内质网、线粒体、细胞膜等都可测定表面积密度，光镜标本中的各种结构也可同样测定。表面积密度是指单位体积参照空间内特征物的表面积，通过数学运算可简便地用以下方法测定：测量单位面积参照面内特征物断面周界线的长度。如果某一个细胞的电镜照片作为参照面，线粒体作为特征物，欲测单位面积电镜照片内线粒体断面周界线的长度，可用以下公式：

SV=2IL

SV表面积密度2IL交点密度

IL=测线与特征物断面周界线之间的交叉点数除以参照面内测线总长度。

为一咱摆线测格，可用来方便地测表面积密度。图中的平行直线不是测线，仅是为了便于计数交叉点和测点而画上的。图中的曲线即摆线，也就是测线，共45条，每条摆线长度d=1/10测格宽度(1cycloid arc=1/10×frame width) ，测格的宽度容易测量，如用目镜测格，可用台微尺测量，如用大的透明胶片，可实际用尺测量，因此每条摆线长度很易算出。测格中共有45条摆线，其总长为45d。

图中直角短线（L）示测点，共90个，测线长度L与测点数P的关联关系为L=d/2·P。具体来说，用图9-7摆线测格，置于一个细胞的超微结构照片上，如果整个测格均位于照片内，则参照面内测线总长度为45d,如果90个测点只有60个落至细胞内（即测格中有30个测点落在此照片外）则参照面内的测线总长度为d/2·P=d/2×60=30d。摆线与特征物（如内质网膜、线粒体的膜等）的交叉点容易数，用上述IL和SV公式即可得出所需参数。此公式为经过数学上的研究而得出，我们可应用公式来作表面积密度的研究。

读者需注意的是：若特征物是各向同性分布，可采用任意方向的随机切片。若特征物呈各向异性分布，可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt等曾提出在一个组织块中作三个互相垂直的切片（three mutually perpendiculer sections ）用作研究。目前通用的垂直切片的概念是1986年Baddeley等人提出，指垂直于某任意确定的水平面的随机切片，或平行于某一任意确定的垂直轴的随机切片。

所示，HP为水平面（horizontal plane），VP为垂直面（vertical planes），二个垂直面互相不是平行关系，成一定角度。在生物组织中，如皮肤的表皮、各种上皮的外表面均可作为水平面，只要与水平面垂直的各个方向所切的切片均为垂直切片。骨骼肌纤维的长轴、长骨的长轴均可作为垂直轴，与其平行的切片也作为垂直切片。

管状的器官如消化管、呼吸管道等，可纵向剖开，展平，当作水平面，在其中作垂直切片所示：以水平面为基准，垂直切片必需在随机的位置和随机的方向，在标本计划中，第一步是需要随机，常用一组系统随机位置的垂直切片（systematic randomly positioned vertical sections），第一个切面是随机的，其余切面则是与第一个切面或一定的角度而选择的，如图中（3）和（4）即表示三个不同的方向，但都垂直于同平面，即垂直切片互相间有一定的旋转角度。图9-7摆线测格中大箭头所示vertical 表示箭头方向与标本垂直轴一致，即verfical 所示方向。

如果有的标本没有可辨认的垂直轴，可任意确定一个水平面，来作垂直切片。

VERTICAL：指垂直轴；

P：水平面；二个VP为垂直面，互相不呈平行关系

六、实例介绍

因为将免疫细胞化学方法与图像分析结合起来进行研究的论文在国内国外都还不多。在第六届国际学术会议上发表的90多篇论文中只有1篇，因此在实例介绍中，包括一部分不是免疫细胞化学方法，而是用其他组织学方法与图像分析结合起来研究，但这种方法对研究免疫细胞化学标本也可借鉴，从中可得到一些启发的，也在此选择性地作一些介绍。

Mcmillan等1983年在第六届国际体视学会议上曾报告了“用图像信息处理机客观评定免疫组织化学染色的组织”，阐明了当组织与第一抗体作用时，不断搅动血清，明显提高了免疫反应。Bordier等1982年用图像分析法对大鼠的神经垂体进行研究，阐明了轴突占神经垂体体积的一半，分泌颗粒占轴突体积的20%，加压素的含量与分泌颗粒的体积密度无关，而与分泌颗粒内激素浓度有关。这些结果如不用图像分析法是很难得出的。Steward等1983年用测量家鸡脑单位面积内的突触数目等，来研究与记忆形成有关的细胞学改变。

英国现在有300万75岁以上的人，其中有五十万人患有老年性痴呆（Alzheimer病），这种病过去认为是由于年龄增长的不可避免的现象。英国神经科学所用图像分析仪与谷氨酸盐受体的放射自显影法结合起来对此病进行了重要的研究。由于放射自显影会产生一些非特异性的结合，用图像分析仪可以从全结合图像减去非特异性结合图像，而得到特异性结合图像，可以测出特异性结合的百分率。目前已知道，老年性痴呆患者脑中，与记忆、理性行为及感情行为有关的区域内，神经元的进行性退变，神经递质发生改变，影响了从一个神经元到另一个神经元的信息传递。

我国1991年11月出版的“计量学在形态学研究中应用学术研讨会论文集“共收集论文123篇，其中有关免疫细胞化学与计量学结合的论文共8篇：①大鼠烫伤后下丘脑室旁核和视上核内AVP含量变化的形态学计量（第二军医大学张忠义等）用图像分析仪测定AVP阳性反应物的面积。②人脊神经节内SP、SK、CGRP免疫反应细胞的比率（中国医科大学方秀斌等），用人工计数方法。③交感神经元和胆碱能神经元中ACh和ChAT显示比较（军事医学科学院汪家政等），用图像分析法测定各种参数。④大鼠脾树状突细胞的组织分布棗S-100蛋白标记和立体计量分析（南京铁道医学院张锦堃等）用目镜标线片的测格进行定量研究。⑤垂体GH腺瘤细胞分泌颗粒的免疫胶体金定位检测及定量分析（中国人民解放军总医院罗毅等），用图像分析法测定各种参数。⑥胃肠粘膜重度异型增生与腺癌细胞核DNA含量的测定及免疫组化的比较研究（上海第二医科大学吴平平等），用显微分光光度系统进行DNA测量。⑦免疫组化在胃癌病理棗生物学分型中的价值（滨州医学院张树毕等），将免疫组化反应分为阳性阴性而进行比较。⑧人胎十二指肠EC细胞的体视学研究（江西医学院朱清仙等）用目镜标线片测格进行定量研究。由此可大致体现我国在此领域的研究现状。

七、图像分析与体视学

图像分析还可用于三维重建，用连续切片可重建立体的原形，在神经组织的研究中很适用。我们在显微镜下观察到的是平面图像，而这些平面图像是从立体结构中切下来的，单凭平面图像不能反映组织的真实结构，例如圆形可以从球形、圆柱形、椭圆形物体中切下。如何从二维结构推导出三维结构，这就是所谓体视学（stereology）所研究的范畴。stereology 这个词是1961年开始正式应用的，由于体视学与图像分析的密切关系，无论是国际上的或国内的学术会议都将这二者放在一起讨论。

将体视学知识与免疫细胞化学标本观察联系起来，将是一种可以获取更多信息的研究手段，目前国外已很重视体视学的研究方法，发表了一些论文，国内也开始做这方面的工作，因此有必要将体视学的一些基本术语介绍给读者，供参阅文献时或自己进行研究时应用。体视学语言目前已是一种通用的术语，现将常用的介绍如下：

结构（structure）：在一个确定的组织模式中，由许多相互依赖的部分所组成的某物体称为结构。一个结构至少有二个组分构成，体视学的目的即弄清楚各组分之间相互关联程度、相对大小等。

组分（component）：在结构中能被截然分开而且能被辨认的部分。

相（phase）：所有在本质上相同的组分的集合称为相。例如一个细胞的所有线粒体构成了此细胞的线粒体相。

粒子（partiele）：假如组分是由许多离散的并且能够作为单元独立存在的要素所组成，则将这些要素称为粒子，粒子可以表现为各种形状。

凸面体（convex solid）：连接此实体内任何两点的线段，必需全部落于此实体内，换句话说，即此实体上切下的一个切片只能形成一个截面。

包容空间（containing space）：指包含被研究的组分的空间。当然，被研究的组分常与其他不被研究的组分并存。

密度（density）：单位体积、单位面积或单位长度内的量。

体积密度（volume density）：在单位包容空间内，某相的体积。

表面积密度（surface density）：单位包容空间内所含有某相的表面积。

长度密度（length density）：单位包容空间内某相的长度。

数密度(numerical density)：单位包容空间内某相的数目。

截面（profile）：任何结构的切片上的图像。

体视学的测量值往往是相对测量值，以两个彼此相关联的测量值的比率来表达，其中一个测量值与组分有关，另一个测量值与包容空间在关，后者也称为“参考系统”。体视学原理可确定在切片上测得的这些比率与空间结构内相应的比率之间的精确关系。上述性质反映在体视学符号中，而这些符号目前已普遍被使用，在有些文献中已不再作解释了。常用的符号如下：

P测试点数

P1单位测试线长上的交点数

Pa单位测试面积上的点数

Pv单位测试体积上的点数　

L测试线长

L1单位测试线长上的截距

La单位测试面积上线的单元长

Lv单位测试体积上线的单元长

A测试面积

S表面积

Aa单位测试面积上被测物的面积

Sv单位测试体积内被测物的表面积

V体积

Vv单位测试体积内被测物的体积

N被测物数目

N1 单位测试线长上与被测物相交的数

NA单位测试线长上与被测物的数

Nv单位测试体积内被测物的数

用测试网格的体视学方法，杨光等，1987年曾对腹腔神经节小强荧光细胞进行超微结构的定量分析，测量了线粒体、溶酶体、粗面内质网、颗粒小泡的Vv、Sv、Na、Nv等参数，得出了标准小强荧光细胞的计量值。此处的Vv即单位体积细胞质内某种细胞器的体积，据体视学原理，Vv等于切片上被测的某种细胞器所占的面积的均数a与细胞质的面积的均数A之比，如用图像分析仪即可得出此二者的面积，而用测试格a等于落在此细胞器上的测试格的交点总数∑Pi，A等于落在细胞质上的测试格交点总数∑Pc。

Vv=ā／A=∑Pi/∑Pc

测试格的交点数有各种规格，如果有20条横测试线与20条纵测试线组成的测试网格，则有400个交点，利用交点所落部位进行推算。

免疫组织化学形态计量研究中参照空间的“陷井”问题。在某种组织结构（参照空间）内测量特征物的密度值（如体积分数、表面积密度、长度密度、数目密度等），如果不知道参照空间的体积，得不到绝对值，就有可能作出错误的结论，就是参照空间的“陷阱”。举一例子说明：实验的结果苯巴比妥对大鼠肝细胞中的内质网的体积分数和表面积密度无显著差异，如果依此就认为苯巴妥对肝细胞（参照空间）内质网无显著影响，就错了，就进入了参照空间的“陷井”中去了。实际上，在些实验条件下，肝细胞质总体积显著增加，因而虽然内质网的体积分数和表面积密度无显著差异，但其绝对值已显著增加了。因此，要测量或估计参照空间的体积、乘以密度值，获得绝对值，才能获正确的结论。