内皮细胞免疫沉淀法制备硫酸蛋白多糖
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内皮细胞培养至90~100%
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PBS洗细胞3遍（室温）
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预热的蛋氨酸和无血清的培养基（MEM）LL nL 50 μM（分子量，383.5，50 mM，25 mg 溶于二甲基硫氧化物DMSO中1304 μl） 在37℃下孵育2小时。
预热的蛋氨酸和无血清的培养基（MEM）LL nL 50 μM（分子量，383.5，50 mM，25 mg 溶于二甲基硫氧化物DMSO中1304 μl） 在37℃下孵育2小时。
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等同于（同步）MEM加1.5%BSA+10 μM LLnL50 μM 在37℃下孵育10分钟。
等同于（同步）MEM加1.5%BSA+10 μM LLnL50 μM 在37℃下孵育10分钟。
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置于冰上，预冷PBS洗细胞3次
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37℃温育2分钟
37℃温育2分钟
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放射性标记：细胞在代谢中以100 μCi/ml［35S］蛋氨酸（14.7 μl）在1.5 ml 的无蛋氨酸MEM中标记60分钟。（25 mM D-glucose medium and Osmotic medium）LLnL50 μM
放射性标记：细胞在代谢中以100 μCi/ml［35S］蛋氨酸（14.7 μl）在1.5 ml 的无蛋氨酸MEM中标记60分钟。（25 mM D-glucose medium and Osmotic medium）LLnL50 μM
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制冷相被（10%FCS）0.5，1，3小时（25 mM D-glucose medium and Osmotic medium）
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细胞提取物制备（0.5 ml 的溶解缓冲液，14000 rpm，离心16分钟）
细胞提取物制备（0.5 ml 的溶解缓冲液，14000 rpm，离心16分钟）
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样品（0.5 ml）+酶抑制剂（50 μl）+苯甲磺酰氟（PMSF 1 M，1 μl）+1×NET 0.5 ml+抗体（抗HSPG 2 μg/mg 细胞蛋白质裂解物）
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在4℃孵育3小时或过夜
在4℃孵育3小时或过夜
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加50 μl 蛋白G琼脂糖凝胶（5~10% in HBS），振荡2~3小时
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沉淀免疫复合物，混合物在室温下6500 rpm离心1分钟，用冰冷的1×NET洗沉淀物3次，弃去上清
沉淀免疫复合物，混合物在室温下6500 rpm离心1分钟，用冰冷的1×NET洗沉淀物3次，弃去上清
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加50 μl 样品缓冲液至沉淀物中，加热100℃4分钟，在冰上迅速冷却，10000 rpm 离心1分钟。
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5%SDS-PAGE跑胶
5%SDS-PAGE跑胶
（凝胶：①在固定液中30分钟：25%甲醇和7.5%乙酸
②在水中30分钟
③30分钟autoflow
干胶，过夜）
PG turnover
同位素35S硫酸盐50 μCi/ml
1. 细胞以50μCi/ml的35S硫酸盐进行放射性标记20小时（过夜）
2. 移去培养基
3. 用PBS洗细胞3次
4. 加含1 mM Na2SO4培养基
5. 在不同的时间段孵化细胞（0，1，2，4，8，24小时）
在培养基和细胞中的总PGs
24孔板，3个孔有相同的浓度
1. 移去培养基：secreted PG（3ml）
2. 以胰蛋白酶抑制剂（0.025%）处理细胞，并在37℃孵育10分钟（移去细胞表面结合的PG）
（1）每孔0.5 ml胰蛋白酶抑制剂（0.025%）
（2）移去（1），放入管中，以每孔0.5 ml PBS+BSA从孔中洗脱残留细胞并放入管中。总共3 ml。
（3）1000 rpm离心10分钟
（4）收集上清于管中测定细胞表面PGs
3. 步骤（3）后收集沉淀物
（1）以1 ml 4 M 盐酸胍处理：细胞内的PGs
乙醇沉淀PG测定
总PG
1. 能整除的PGs加3×体积的ETOH包含0.8 g Na醋酸盐
2. 样品用15 ml 管
（1）培养基样品（2 ml）加6 ml EtOH
（2）胰蛋白酶抑制剂样品（2 ml）加6 ml EtOH
（3）胍样品（2 ml）加6 ml EtOH
3. 每个管加50 μl CS载体（1 mg/ml）
4. 在-20℃冰箱中孵育一夜
5. 2000 rmp离心1小时
6. 移去上清
7. 在0.5 N NaOH（1 ml）中溶解沉淀物
8. 移至小玻璃瓶中，加闪烁液并计数
软骨素酶ABC处理后测定
试剂
（1）酶缓冲液：1 mM Tris，30 mM 醋酸钠（Na acetate），10 mM EDTA，PH值8.0
（2）BSA 1 mg/ml
（3）n-ethyimalemicle（NEM）0.1 M
（4）胃蛋白酶抑制素（pepstatin 7.2 mM）和PMSF（0.1 mM）溶解于甲醇
（5）1小瓶软骨素酶ABC （5单位）溶于0.5 ml 缓冲液中
方法
（1）透析剩余样品（1mLt）（培养基，胰蛋白酶抑制剂和胍）入（into）酶缓冲液一夜
（2）每个透析样品加液如下
| 样品 | 体积 | NEM | PMSF/Pepst | BSA | CSABC | CS carrier |
| 培养基(Medium) | 1ml | 100μl | 10μl | 30μl | 10μl | 50μl |
| 胰蛋白酶抑制剂(Trypsin) | 1ml | 100μl | 10μl | 30μl | 10μl | 50μl |
| 细胞胍(Cell guanidine) | 1ml | 100μl | 10μl | 30μl | 10μl | 50μl |
（3）在37℃水浴中孵育过夜
（4）加ETOH（样品的3倍体积）并在-20℃孵育18小时
（5）2000 rmp，4℃离心1小时，分离EtOH ppt
（6）在0.5 N NaOH（1 ml）中计数沉淀物HSPG
