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        戊二醛二步交联法制备酶标抗体

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        相关专题

        戊二醛连接反应

        戊二醛(glutaraldehyde,GA):是一种常用的同型双功能交联剂,它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱(-N=C-),将他们以五碳桥连接起来。

        戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4-40℃范围,pH6.0-8.0的缓冲液中进行。另外,GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长,可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。

        操作步骤

        1. 用0.05mol/L, PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS)将25%戊二醛稀释至5%;

        2. 称取5mgHRP 溶于0.5ml 5%戊二醛,37℃水浴结合2h;

        3. 加入220.0g/L NaCl 0.1ml, 充分混匀后,置4℃10min预冷;

        4. 加冷无水乙醇2.4ml,颠倒混合,立即1000r/min离心10min;

        5. 弃上清,沉淀用冷80%乙醇洗一次,将离心管倒置,控干;

        6. 加入0.05mol/L, PH9.5 CBS 0.5ml溶解沉淀物;

        7. 将5mg抗体溶于0.5ml 0.15mol/L NaCl,再与醛化HRP溶液混合;

        8. 加入1.0mol/L, pH9.5 CBS,调节pH值至9.0-9.5;

        9. 于4℃,电磁搅拌下结合24h;

        10. 加入0.1ml O.2mol/L赖氨酸,以封闭残留的醛基,终止反应;

        11. 4℃放置2h;

        12. 将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱,用PBS洗脱,收集第一洗脱峰;或将反应物装入透析袋,对0.01mol/L,pH7.2 PBS,4℃透析过夜并收集; 即为酶标记抗体。

        注意事项

        1. 所用的戊二醛A235/A280为10左右,未经蒸馏等处理。

        2. 酶的醛化时间37℃2h、4h和4℃16h无明显区别。

        3. 醛化时,使用的缓冲液以CBS为宜。

        4. 加入220.0g/L NaCl 的目的主要是提高离子强度,以便乙醇沉淀。

        5. 根据有关文献的报道,用50%饱和硫酸铵盐析或Sephadex G-200凝胶柱层析,对于ELISA检测并无实际意义,并常使酶与抗体的活性大量丧失,且这两种纯化法不能去除未标记的抗体,需用ConA-Sepharose 4B纯化才能达到,因此,在常规工作中,盐析和过柱的纯化步骤可以省

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