• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        硫酸铵沉淀法

        相关实验:IgG 的分离与提纯实验

        最新修订时间:

        原理

        硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
         

        材料与仪器

        步骤

        一、材料与试剂配制
         
        1.  动物血清
         
        2.  硫酸铵饱和溶液
         
        硫酸铵:800 g~850 g
         
        H2O :1 000 ml
         
        加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28% NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。
         
        注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
         
        3.  0.01 mol/L pH7.4 PB液
         
        A液:0.10 mol/L NaH2PO4
         
        NaH2PO4·2H2O :15.60 g
         
        加H2O至1 000 ml
         
        B液:0.10Mol/L Na2HPO4
         
        Na2HPO4·12H2O: 35.80 g
         
        加H2O至1 000 ml
         
        取A液19 ml,B液81 ml加水至1 000 ml即可。
         
        4.  1%BaCl2溶液
         
        5.  纳氏液
         
        HgI :115.00 g
         
        KI: 80.00g
         
        加H2O至500.00 ml
         
        溶化后过滤,然后再加20%NaOH 500.00 ml,混合即可。
         
        6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液
         
        7、洗脱液
         
        0.03 mol/L的NaCl液。
         
        8、透析袋(或玻璃纸)
         
        二、操作方法
         
        1.  取20 ml血清,加生理盐水20 ml,再逐滴加入(NH42SO4饱和溶液10 ml,使成20%(NH42SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30 min。
         
        2.  3 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
         
        3.  在上清液中再加(NH42SO4饱和溶液30 ml,使成50%(NH42SO4溶液,充分混合,静置30 min。
         
        4.  3 000 r/min离心20 min,弃上清。
         
        5.  于沉淀中加20 ml生理盐水,使之溶解,再加(NH42SO4饱和溶液10 ml,使成33%(NH42SO4溶液,充分混合后,静置30 min。
         
        6.  3 000 r/min离心20 min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。
         
        7.  用10 ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
         
        8.  透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24 h,中间换液数次。
         
        以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 (取3~4 ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4 存在),直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
         
        9.  离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
         
        10.  过DEAE-纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS(0.03 mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。
         
        11.  蛋白质及其定量鉴定。
         
        12.  IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。
         
        (1)区带电泳
         
        玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
         
        (2)琼脂双相双扩散鉴定
         
        预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
         
        (3)免疫电泳鉴定
         
        孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
         
        (4)圆盘电泳鉴定
         
        用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。
         
        13.  IgG的浓缩与保存
         
        (1)IgG的浓缩
         
        (2)IgG的保存
         
        一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。

        注意事项

        一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。

        常见问题

        纯化IgG小量几十ml的话,用protein A或protein G就可以,疏水柱等也可以纯化;大量的话,上百ml,可以使用streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序