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        硫酸铵沉淀法

        最新修订时间:

        原理

        当高浓度盐存在时,蛋白质往往凝聚并析出沉淀。这一技术称为「盐析」。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀,所以盐析常用于蛋白质的分离纯化。几种因素如 pH 、温度、蛋白质纯度在测定各种蛋白质的盐析时起着重要作用。


        选择硫酸铵是因为它具有一些优良性质,如盐析的有效性、pH 范围广、溶解度高、溶液散热少和经济适用。


        硫酸铵浓度常以百分浓度表示,以 X% 表示所需配制的溶液浓度,表示开始的溶液浓度,所需的硫酸铵克数按以下公式计箅:


        g=515(X-X0)/(100-0.27X)


        大多数蛋白质在 55% 硫酸铵中沉淀,获得最大量蛋白质沉淀是 85% 硫酸铵溶液,以不含硫酸铵的 100 ml 蛋白质溶液为起始溶液。

        材料与仪器

        步骤

        1. 将盛有蛋白质溶液的烧杯放在装另一装有冰水的大烧杯内,并置于磁力搅拌器上搅拌;


        2. 边搅拌,边徐徐加入 56.8 g 硫酸铵至饱和,该步骤应在 5~10 min 内完成;


        3. 继续搅拌 10~30 min;


        4. 10 000×g 离心 10 min 或 3000×g 30 min;


        5. 弃去上清液。将沉淀悬浮于 1~2 倍沉淀物体积的缓冲液中,残留的不溶性物质可能是变性蛋白,通过离心除去;


        6. 硫酸铵能够通过透析,超滤或脱盐柱除去。

        注意事项

        1. 搅拌必须是有规则的和温和的。搅拌太快将引起蛋白质变性,其变性特征是起泡。用磁力搅拌器不明显产热,这一点也很重要。


        2. 大多数蛋白质在盐溶解后的前 20 min 沉淀,一些蛋白质要经数小时才能完全沉淀。


        3. 为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用,沉淀反应至少应在 50 mmol/L 缓冲液中进行。


        4. 缓冲液应含有鳌合剂如 EDTA 以除去硫酸铵中微量的重金属离子,因为这些离子对目的蛋白质是有害的。


        5. 为确保获得最大量沉淀,使用蛋白质初始浓度至少为 1mg/ml。


        6. 硫酸铵沉淀反应通常是贮存和稳定蛋白质的良好方法。


        7. 少数蛋白质在硫酸铵浓度低于 24% 时就产生沉淀,而大多数要在 80% 以上才能沉淀。在纯化的初始阶段,常利用蛋白质在硫酸铵中溶解度的差异分离蛋白质。硫酸铵沉淀可除去 RNA 和 DNA。


        8. 在蛋白质的等电点其溶解度降低,在此条件下,静电的相互作用可导致蛋白质凝聚和沉淀在蛋白质的等电点,低浓度的硫酸铵就能沉淀蛋白质。


        9. 在蛋白质结晶实验中,采用硫酸铵沉淀十分有效。

        来源:丁香实验

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