正常大鼠主动脉内皮细胞的培养

实验材料：

1. 大鼠主动脉血管；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 培养用液：M199培养液或RPMI1640培养液（含20%小牛血清，pH7.2）；0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA（1:1，V：V）混合消化液；D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素；1%明胶溶液；

4. 培养器具：培养瓶或皿、白内障、眼科剪、镊子等；

培养方法：

1． 将大鼠颈椎脱臼或颈动脉放血处死后，将整个大鼠泡于75%乙醇中消毒1min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌D-Hanks液培养皿中；

2． 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中；

3． 用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1.5mm×1.5mm大小的动脉植块，然后种植到培养瓶或培养皿中（培养瓶或皿用1%明胶预置4℃下过夜，使用前2h移入37℃，5%CO2 培养箱中。用时可以先经含20%小牛血清的M199或RPMI1640培养液冲洗）。将动脉植块的内膜面与瓶底（或皿底）接触，种植密度约为1块/cm2 ；

4． 置37℃，5%CO2培养箱中（湿度100%）静置2h（干贴壁）。培养瓶皿若不用明胶包被则为0.5—1h。然后，加入少许含20%小牛血清的M199培养液或RPMI1640培养液（pH7.2），液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜；

5． 72h后，当细胞达一定密度时，将动脉植块除去。换培养液1次。以后每2d换液1次，每次换1/2—2/3的液量。继续培养8—10d，细胞融合成单层，即可传代；