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        大鼠主动脉内皮细胞的培养

        互联网

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        材料与方法:

        材料 :

        培养皿、培养瓶、烧瓶、试管,玻璃针等。

        眼科剪、眼科镊、手术刀片。

        5%CO2孵箱、PH计。

        恒温水浴箱。

        PMi1640培养基,D-Hank’s缓冲液 、胎牛血清,内皮生长因子(ECGF),青霉素,链霉素,戊巴比妥钠等。

        方法:

        1、取材:4~6wWistar大鼠, 大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死,将处死后的大鼠浸入75%酒精中,放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔,分离胸主动脉,用2ml注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段,两端结扎剪断,放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基(含双抗)中。

        2、剪切:在超净台上,将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中,用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1~1.5mm的环。

        3、接种:将动脉环竖直放入35mm培养皿(1%明胶4℃预置过夜,用前2h移入CO2培养箱,用前培养液冲洗)中。置CO2培养箱2h后,加入1.5ml培养基。放入37℃,5%CO2培养箱中培养。72h后细胞从环内外生长迁出,环内为内皮细胞,环外为成纤维细胞。将动脉环除去后,可看到内膜面细胞集落与外膜面之间有明显的无细胞区界限,用玻璃针剔除成纤维细胞,得到纯的内皮细胞生长克隆。继续培养10~15d,此时FBS浓度为20%,形成细胞单层。

        4、置于5%CO2孵箱中培养,每隔3天换液,培养时添加15% FBS,5~10μg/ml的内皮细胞生长因子(ECGF)以及100μg/ml的肝素。待细胞90%~95%融合时,0.25胰蛋白酶消化传代。

        5、内皮细胞鉴定:相差显微镜下,细胞呈单层铺路石状;免疫组化证明有vWF相关抗原存在。

        6、注意事项:将分离出来的主动脉热处理时温度以60℃2秒为宜,太低则成纤维细胞多,太高或时间久则内皮细胞迁出减少。

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