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        分离牛主动脉内皮细胞(PAECs)

        相关实验:血管内皮细胞的分离和培养

        最新修订时间:

        原理

        本方法是由 Bravery 等 [ 1995 ] 的方法改写的。

        材料与仪器

        步骤

        1. 将铝箔铺在软木板上。

        2. 将主动脉(新鲜猪主动脉:如条件允许,需无菌取材。放入 HBSS/PSGA 中转运)放于 70 % 乙醇浸泡的棉纸上面,然后轻拍动脉以吸干表面的液体。

        3. 在铝箔覆盖的软木板上,修剪主动脉周围组织,只保留分支。不要将分支剪得过短。

        4. 用线结扎分支,夹住主动脉细端。

        5. 注入 D-PBSA,将主动脉充满,然后夹住主动脉上端。

        6. 用无菌鳄鱼夹将漏液处夹闭。

        7. 吸出 D-PBSA。

        8. 用温胶原蛋白酶(胶原蛋白酶H : 同 HUVEC 分离方法中的材料,50 ml)液充满主动脉,然后夹闭动脉。用乙醇喷过的塑料薄膜包裹主动脉,在 37°C 条件下放置 8 min。

        9. 轻轻按摩主动脉,使内皮细胞脱落。

        10. 让主动脉中的胶原蛋白酶液流人盛有 5 ml FBS 的 50 ml 试管。

        11. 用冰冷的 D-PBSA 充满主动脉,随后夹闭动脉。按摩后让 D-PBSA 流入步骤 10 中用的试管。然后,重复此步骤一次。

        12. 在 4°C 条件下离心(500 g,6 min)。

        13. 用 5 ml 培养液混悬细胞,将细胞悬液注入 25 cm2 培养瓶,在 37°C 条件下培养过夜。

        14. 第二天吸去培养液。

        15. 用 D-PBSA 洗细胞 2 次,然后加入培养液。

        维持培养

        16. 每周换培养液 3 次。如果细胞单层不足 50 % ,只换一半培养液。若细胞单层达 50 %~80 % ,换全部培养液。

        17. 当细胞单层达 80 % 时,用胰蛋白酶和 EDTA 混合液消化,按 1 : 3 传代。

        18. 不要使用超过 7 代的细胞。

        来源:丁香实验

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