做 real-time PCR之前，你应该如何着手设计引物？做哪些准备？看完必会！

正在着手做 real-time PCR 的朋友们，我想最开始肯定要考虑引物设计的问题。

看完下面的文字，我保证你得到想要的引物设计方法和引物序列。

第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告诉我你不会找序列。如果真的不会，请参考丁香园内其他版块，如NCBI使用，序列查找等。

第二步：确定你想用哪种方法。Taqman Probe 还是 SYBR 染料？

两种方法各有利弊，这里不赘述，不明白的依然参见其他版块。但需要指出的是，后者在国内更常用，因为比较简单，容易操作，容易分析。建议初学者选择。

第三步：动手设计引物

1）两种引物设计软件。

在设计 real-time PCR 引物时，常用的有非常 NB 的 primer premier 5.0 和 primer express 3.0 (升级版有5.0)。前者可以应用与常规PCR和real-time PCR；后者是ABI公司的real-time PCR仪器配套的引物设计软件，专门为real-time PCR设计。

2）选择哪个软件合适？

在第二步中，我已经说过，你要先确定你选择哪个方法。如果你想用 Taqman Probe 法，请你选择 primer express 3.0。如果你想用 SYBR 法，我建议你选 primer premier 5.0。

为什么？请往下看。

3）两种引物设计软件之比较。

先说专门为 real-time PCR 定制的 primer express 3.0 。这个软件其实是为 Taqman 探针法设计的，而不适合SYBR染料法。

如果你用探针法，强烈推荐。打开软件就会发现，在方法选择的下拉菜单中，都是 Taqman 探针法，没有染料法。结果导致，在你进行引物遴选的时候，都要考虑到「位于上下游引物之间的探针，以及探针与上下游引物的联系」］最终把条件限制的很窄。而染料法相对于探针法，条件相对宽泛。最终，你得不到满意的染料法的引物。在升级版中，是否有解决，我不知道，也没用过升级版。

由于primer express 3.0 的局限性，使得采用染料法的朋友们，不得不求助于 primer premier 5.0。具体使用方法可以在论坛里搜索。但是，需要一些遴选条件。见下面的附件。

第四步：如果你比较懒，自己又学不会用软件。

那么，请你求助有强大的 google 和百度。搜索模式：A（你所关注的基因名称）+B（real-time PCR）google 或A（你所关注的基因名称）+C（荧光定量PCR）百度。然后下载那篇文章，找到你要的序列的引物。

第五步：如果没有人比你更懒，那么，请你在丁香园的引物板块寻找你的引物是否有人提供到数据库了，如果找不到（相信大部分找不到），那你发帖求助。

第六步：我把我找到的，验证比较好的 β-antin 荧光定量PCR引物和 GAPDH 荧光定量PCR引物（SYBR法）分享。大家参考。

本文来源于丁香园论坛，作者：sanping88

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