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        【求助】基因检测,极度困难,十分无助,请帮忙

        丁香园论坛

        2152
        本人目前在做肺癌基因检测,靶标方面的研究,手上的标本均为05---08年肺穿刺、气管镜的组织标本,既往曾经过福尔马林固定,石蜡包埋等处理,切片后行LCM(显微切割)选出肿瘤区域。

        小片组织细胞数约为50个细胞,我们的后续方法为从这样的标本组织中提取DNA(应用蛋白酶水解过夜,在蛋白酶失活方法,经过验证新近标本,均可成功),然后巢式PCR扩增,最后测序比对可能出现的突变或者缺失。

        我们检测的基因为EGFR及KRAS

        问题:1、这批标本PCR后跑琼脂糖凝胶电泳,根本没有条带,不知是pcr扩增失败,还是因为我们样本原因,DNA太少,不能成功。

        2、标本已经没办法改变了,不管是否因为石蜡包埋年代久远还是样本量太少,不知各位战友有没有好办法,提DNA,目前我已尝试的办法有:QIAamp试剂盒,传统酚氯仿抽提,蛋白酶直接裂解煮沸法,磁珠法提DNA,均不能成功

        3、目前基因检测金标准还是测序,但是鉴于我们的情况,对于AMOS或者HRM,或者是广州益善公司的液相芯片,大家觉得哪个方法可以尝试呢?

        希望大家能帮帮忙,万分感谢!
        请教各位专家了,谢谢了, 很棘手
        还是没有什么好的建议吗?
        外行不懂,提点建议。你首先得确定你的PCR检测灵敏度多少。你提取的DNA有没有进行定量?可以试试将标本直接裂解后,用裂解液梯度稀释,然后做PCR。
        对于你这种情况,建议如下:
        1.对于这种标本,建议用针对性的试剂盒提取,并跑电泳检测基因组DNA,不过我估计应该含量比较低,看不到;
        2.PCR建议用好的酶扩,并做阳性对照,检测引物的扩增效率和监测PCR成功与否;
        3.扩增的片段最好尽可能短,但是也不要太短。
        PCR片段长度控制在150bp左右,再试试

        应该不是DNA量少的缘故
        freecell wrote:
        外行不懂,提点建议。你首先得确定你的PCR检测灵敏度多少。你提取的DNA有没有进行定量?可以试试将标本直接裂解后,用裂解液梯度稀释,然后做PCR。

        大家一起学习,谢谢了

        裂解液稀释浓度梯度尝试过了,小体系,不加水,全加模板都试过了,效果不好

        pcr机器是bio-rad的,灵敏度我确实不知道
        chimengdeyu wrote:
        PCR片段长度控制在150bp左右,再试试

        应该不是DNA量少的缘故

        谢谢你的回复,您的意思是不是说Dundefined*段化了,都是150bp的小片段了所以扩不出来呢?
        可以试一下HRM,因为HRM仪器的灵敏度比较高,即使PCR产物量很低,也能检测到!但是需要做PCR的特异性要好!
        重复多次扩增

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】基因检测,极度困难,十分无助,请帮忙

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