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        His标签蛋白纯化效果不理想?小贴士来帮你!

        Cytiva(思拓凡)

        4136
        His 标签蛋白纯化效果不理想,宝宝心里苦呀。今天,小编来跟大家一起找找原因。

        纯化所得组分中没有收集到重组的His标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面:

        1、His标签蛋白没有结合到填料上就流穿了
        原因一
        超声的功率不对。超声功率过高,容易导致蛋白炭化;功率过低,蛋白释放不出来。
        建议
        改变超声功率,同时可以在超声前加入溶菌酶。
        原因二
        结合缓冲液条件不合适。
        建议
        检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素,如:金属离子螯合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。同时,优化缓冲液的pH、盐离子浓度、添加剂(如5%甘油、1mM DTT)等。
        原因三
        His标签没有表达或丢失或暴露不充分。
        建议1
        用anti-His的抗体进行WB,检测His标签是否存在。
        建议2
        将蛋白用4-6M盐酸胍或4-8M尿素变性后,让His标签充分暴露出来,看是否能与填料结合。
        建议3
        改变His标签的位置或者增加其数目(常用6-12个His),增加暴露和结合机会。
        建议4
        改变金属结合离子,除了Ni2+,Cu2+、Zn2+、Co2+也可以用来进行His标签的捕获。

        2、His标签蛋白结合了,但是洗脱不充分
        原因一

        洗脱条件太温和。
        建议
        增加咪唑的浓度或选择咪唑线性梯度洗脱,或者通过降低pH寻找最佳洗脱条件。需要注意的是,pH低于3.5容易导致镍离子脱落。
        原因二
        蛋白柱上沉淀。
        建议1
        降低蛋白浓度。可以减少上样量,或者采用咪唑线性而非步级梯度洗脱,增加蛋白稀释度。
        建议2
        试用去污剂或者改变NaCl的浓度,或者使用变性剂(4-6M盐酸胍或4-8M尿素)在变性条件下洗脱。
        原因三
        非特异性的疏水或者其他相互作用。
        建议
        加非离子型去污剂到洗脱缓冲液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl的浓度洗脱。

        是不是很有收获,快去试试吧!


        His标签蛋白纯化效果不理想?小贴士来帮你!

         
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