如何提高 HIS 标签蛋白纯化效果

HIS 标签蛋白纯化效果不理想，宝宝心里苦呀。今天，小编来跟大家一起找找原因。

纯化所得组分中没有收集到重组的 HIS 标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面： 

 

1、HIS 标签蛋白没有结合到填料上就流穿了

原因一 

超声的功率不对。超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。

建议

改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。

 

原因二

结合缓冲液条件不合适。

建议

检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螫合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。同时，优化缓冲液的 pH、盐离子浓度、添加剂（如 5% 甘油、1mM DTT) 等。

 

原因三

HIS 标签没有表达或丢失或暴露不充分。

建议 1

用 anti-HIS 的抗体进行 WB，检测 HIS 标签是否存在。

建议 2

将蛋白用 4-6M 盐酸胍或 4-8M 尿素变性后，让 HIS 标签充分暴露出来，看是否能与填料结合。

建议 3

改变 HIS 标签的位置或者增加其数目（常用 6-12 个 HIS），增加暴露和结合机会。

建议 4

改变金属结合离子，除了 Ni²⁺，Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺ 也可以用来进行 HIS 标签的捕获。

 

 

2、HIS标签蛋白结合了，但是洗脱不充分

原因一

洗脱条件太温和。

建议

增加咪唑的浓度或选择咪唑线性梯度洗脱，或者通过降低 pH 寻找最佳洗脱条件。需要注意的是，pH 低于 3.5 容易导致镍离子脱落。

原因二

蛋白柱上沉淀。

建议 1

降低蛋白浓度。可以减少上样量，或者采用咪唑线性而非步级梯度洗脱，增加蛋白稀释度。

建议 2

试用去污剂或者改变 NaCl 的浓度，或者使用变性剂 (4-6M 盐酸胍或 4-8M 尿素） 在变性条件下洗脱。

原因三

非特异性的疏水或者其他相互作用。

建议

加非离子型去污剂到洗脱缓冲液（如：2% Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度洗脱。

 

是不是很有收获，快去试试吧！