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        逆转录(RT)实验步骤

        互联网

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        一、准备工作

        1、实验器具与材料:

        (1)移液枪:200ul、10ul

        (2)吸头:200ul、20ul

        (3)EP管1。5ml、100ul

        (4)水浴箱

        2、实验器具的处理与准备

        塑料制品:(包括吸头、EP管等)

        将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。

        3、试剂配制和准备:

        (1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1。5mlEP管中,-20℃中保存备用。

        (2)RT中所需要的各种试剂

        (3)引物浓度计算方法:(新合成的引物的稀释)假如终浓度为XuM(pmol/ul)加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)

        二、RT时注意事项:

        为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。

        三、RT步骤

        (一)用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)

        1、准备0、65ml的EP管

        2、冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。

        3、65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。

        4、短暂离心后,冰上操作:加入4ul5×First-StrandBuffer,1ul0.1MDTT,1ulRNAse Inhibitor,1ulSSⅢ逆转录酶。

        5、短暂离心

        6、50℃水浴60分钟进行逆转录。

        7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶

        8、-20℃保存,或立即进行PCR。

        (二)用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)

        1、准备0.65mlEP管

        2、加入4.5ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA

        3、稍离心,100℃沸水裕1min

        4、加入0.5uldNTP,2ul5×Buffer,1ulAMV逆转录酶

        5、稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT

        6、100℃沸水裕3min灭活AMV

        7、立即PCR或-20℃保存。

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