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逆转录病毒包装/逆转录病毒载体/Retrovirus

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和元生物技术(上海)股份有限公司
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简介: 和元生物可以提供高滴度逆转录病毒,满足各类科研实验需求
提供商: 和元上海
服务名称: 逆转录病毒包装/逆转录病毒载体/Retrovirus
地区: 上海
规格: TU/ml

逆转录病毒包装/逆转录病毒载体/Retrovirus

 

逆转录病毒介绍:

逆转录病毒(Retrovirus)是一种RNA病毒,在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。它的基因组有三个基因:gag-编码病毒的核心蛋白;pol-编码逆转录酶;env-编码病毒的被膜糖蛋白。

逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间,逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此,逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制(图1)。和元上海包装高滴度逆转录病毒,供不同实验需求。

逆转录病毒作用机制

图1 逆转录病毒作用机制

逆转录病毒用于分裂细胞特异性感染,表达稳定高效。逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异,据此可将其分为三类:
    (1)单嗜性逆转录病毒(ectropic retrovirus),只感染小鼠和少数几个品种的大鼠;
    (2)兼嗜性逆转录病毒(amphotropic retrovius),能感染小鼠的细胞,也能感染其他种属动物的细胞;
    (3)异嗜性逆转录病毒(xenotropic retrovirus),能感染多种动物细胞,但不能感染小鼠细胞。

 

目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒,即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白(Env)决定,病毒基因组不影响其靶向性,不同的基因组可用相同的Env包被,且Env来自何种病毒,包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。

和元上海逆转录病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒滴度进行测定。一般情况下我们的逆转录病毒滴度在107~108TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。

病毒相关技术服务:

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逆转录病毒包装纯化实验报告摘要:和元生物使用兼嗜性逆转录病毒包装系统获得高滴度的过表达EGFP基因的逆转录病毒颗粒。该逆转录病毒系统中外源基因的表达框为pRetro-CMV-EGFP-3FLAG-SV40-Puro:CMV启动子驱动EGFP基因的表达,同时由SV40启动子驱动puromycin抗性基因的表达, 用于快速筛选稳定细胞株。关键词:兼嗜性逆转录病毒包装系统,EGFP,高滴度逆转录病毒包装,逆转录病毒纯化,和元生物一、 实验原理逆转录病毒是需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。逆转录病毒是RNA病毒,它有三个基因:gag-编码病毒的核心蛋白;pol-编码逆转录酶;env-编码病毒的被膜糖蛋白。逆转录病毒的DNA插入宿主细胞染色体时,在5’LTR的U3左端和3’端LTR的U5右端各丢失2 bp,而在宿主染色体插入位点上生成4~6 bp的重复序列。逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。每个受感染的细胞一般有1~10份前病毒拷贝。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间,逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此,逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制。逆转录病毒可以与多种细胞表面蛋白结合而进入细胞,其宿主细胞范围很广。逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异,据此可将其分为三类:(1)单嗜性逆转录病毒(ectropic retrovirus),只感染小鼠和少数几个品种的大鼠;(2)兼嗜性逆转录病毒(amphotropic retrovius),能感染小鼠的细胞,也能感染其他种属动物的细胞;(3)异嗜性逆转录病毒(xenotropic retrovirus),能感染多种动物细胞,但不能感染小鼠细胞。目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒,即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白(Env)决定,病毒基因组不影响其靶向性,不同的基因组可用相同的Env包被,且Env来自何种病毒,包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。 逆转录病毒载体系统共由两部分组成:包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中,去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号,通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上,而包装细胞系
逆转录病毒包装/逆转录病毒载体/Retrovirus  逆转录病毒介绍:逆转录病毒(Retrovirus)是一种RNA病毒,在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。它的基因组有三个基因:gag-编码病毒的核心蛋白;pol-编码逆转录酶;env-编码病毒的被膜糖蛋白。逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间,逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此,逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制(图1)。和元上海包装高滴度逆转录病毒,供不同实验需求。图1 逆转录病毒作用机制逆转录病毒用于分裂细胞特异性感染,表达稳定高效。逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异,据此可将其分为三类:    (1)单嗜性逆转录病毒(ectropic retrovirus),只感染小鼠和少数几个品种的大鼠;    (2)兼嗜性逆转录病毒(amphotropic retrovius),能感染小鼠的细胞,也能感染其他种属动物的细胞;    (3)异嗜性逆转录病毒(xenotropic retrovirus),能感染多种动物细胞,但不能感染小鼠细胞。 目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒,即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白(Env)决定,病毒基因组不影响其靶向性,不同的基因组可用相同的Env包被,且Env来自何种病毒,包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。和元上海逆转录病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒滴度进行测定。一般情况下我们的逆转录病毒滴度在107~108TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。病毒相关技术服务:病毒包装服务     腺相关病毒包装     慢病毒包装    腺病毒包装     逆转录病毒包装
 逆转录病毒包装一、逆转录病毒包装服务介绍       逆转录病毒(Retrovirus)是一类RNA病毒。在逆转录酶的作用下,以病毒RNA为模板合成 cDNA 再通过 DNA 复制、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统,由逆转录病毒载体、辅助载体(表达病毒包装需要的蛋白质)和包装细胞系组成。逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、基因治疗、生物制药等得到广泛的应用。逆转录病毒载体主要优点:转染范围广,可以感染各种细胞类型,转入的外源基因可完全融合,对细胞感染率高,感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。       逆转录病毒载体系统共有两部分组成:包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中,去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号,通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上,而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后,缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其它宿主细胞,此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中,导致插入序列在宿主细胞中表达,产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白,因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。       沃登医学的逆转录病毒载体构建及表达技术转染范围广,可以感染各种类型细胞;感染率高达100%。逆转录病毒载体表达示意图 二、逆转录病毒包装服务内容 1.含目的基因的逆转录病毒载体的构建和纯化提取;2.逆转录病毒表达载体和辅助质粒共转染293T细胞;3.转染48 h后,收获逆转录病毒上清,移出上清,用滤膜过滤,或在4oC条件下以500 g离心5 min以除去活细胞;4.如果在1~2 h内使用逆转录病毒上清,将其放置在冰上,若时间间隔较长时,置于干冰上冰冻,而后转到-70oC储存;5.融化冰冻的上清,在37oC条件下加温片刻,立即使用。 三、逆转录病毒包装服务说明 1.客户提供:所需表达的外源基因名称或序列和所要选择的穿梭载体。2.服务周期:2周。3.若另有疑问欢迎致电本公司咨询,我们将竭诚为您服务。 四、逆转录病毒包装质量承诺 1.重组载体质粒;2.沃登医学bmw
汉恒高滴度逆转录病毒                    髓系细胞:K562   U937   THP-1   L1210   HL-60 ………淋系细胞: A3  Supb15   Reh  Jurkat ……… NK系细胞:NK92           原代细胞:造血干(LSK) 原代T,B,NK,PBMC  你还为转染这些细胞而苦恼吗?汉恒高滴度逆转录病毒轻松搞定!! 【逆转录病毒试用装可以申请免费试用啦】 试用装规格 【限量100份(GFP),体积50ul  】【滴度不低于1x10的8次方TU/ml 】 汉恒还可根据客户具体需求给出特定的逆转录试用装。 逆转录病毒感染策略 逆转录病毒本身的病毒滴度不高,感染细胞时病毒消耗量较大,试用装体积较小,建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转,因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞,然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。 注意:对于一些传代能力较差的原代细胞,比如BMSC等,建议采用腺病毒感染。 逆转录病毒感染关键知识点 1)细胞准备:由于试用装体积有限,请使用96孔板准备细胞,逆转录病毒感染细胞前,请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%~60%间为宜。2)感染细胞最佳MOI的测定:MOI(感染复数)是指每个细胞感染的病毒数。      逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞,其最适MOI各有差别,原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。MOI一般以3,10,30,100的比例递增进行梯度摸索,一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI可从3为开始,即设立4个常规的MOI摸索,即3,10,30,100。3) 助转剂polybrene的选择:实验证明,polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率,但polybrene有一定的细胞毒性,不同细胞对polybrene的敏感度不同,polybrene最常用的工作浓度为5~8μg/ml。4)MOI对应病毒体积的换算(非常重要)感染时细胞数(一般以传代计数细胞数×2计算)×MOI=病毒个数;则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。  (1)逆转录病毒感染图片(2)逆转录病

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