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        逆转录PCR的实验步骤

        互联网

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        一、实验器具与材料:

        1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

        2、吸头:1ml、200μl、20μl

        3、匀浆管:5ml

        4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

        5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

        6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖);1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)

        7、量筒:50ml、250ml、500ml

        8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml

        9、试管架:5ml、1.5ml、20μl

        10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

        11、铝制饭盒:4个

        12、塑料小饭盒:1个

        13、大瓷缸:2个

        14、锡泊纸:一卷

        15、卷纸:2卷

        16、三角烧瓶:带盖,稍大

        二、实验器具的处理与准备

        1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)
        先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)

        2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)

        3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)

        三、试剂配制:

        1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

        2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)

        3、异丙醇:放入棕色瓶中

        4、氯仿:放入棕色瓶中

        5、琼脂糖

        四、几种缓冲液的配制:

        1、电泳缓冲液:

        Tris 54g
        硼酸 27.5g
        0.5M EDTA 20ml pH8.0
        蒸溜水 1000ml
        5×TBE (贮存液)
        再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液

        2、上样缓冲液:

        0.25%溴酚蓝
        0.25%二甲苯青FF
        30%甘油
        6×缓冲液,4℃保存

        五、琼脂糖凝胶的配制:

        1、1.0%: 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。

        2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为1.5g

        六、需购置的Rt-PCR材料:

        Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
        dNTP: 1支
        oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
        M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
        RNasin: 1支 110
        -- -20℃
        DEPC 5g 110.00
        Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
        -- 4℃
        Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00

        七、引物合成

        1. 正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
        反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′

        2、par-4:
        正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
        反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′

        3、退火温度计算:
        2(A T) 4(G C)
        正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)

        4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好

        5、引物稀释:
        加DEPC水量为(μl)= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
        是为10p mol / μl 浓度的引物溶液

        八、PCR产物电泳

        先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。

        九、几个注意点:

        1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。

        2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。

        3、RNA抽提前,打开离心机预冷。

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