RT-PCR实验步骤
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一、组织抽提：
1. 取组织块 50-100 �用液氮在研钵中研磨成粉末
2. 移入玻璃匀浆器加入 1ml Trizol 抽打匀浆
3. 移入 1.5ml 新离心管用 5 ml 针头抽打
4. 冰上孵育 5 分钟
5. 离心 12,000g 4 ℃ 5 分钟 取上清液移入 1.5ml 新离心管
6. 加 0.2 ml 氯仿，震荡，冰上孵育 5 分钟
7. 离心 <12,000g 4 ℃ 10 分钟 取上层液相移入 1.5ml 新离心管
8. 加 0.5 ml 异丙醇，震荡，冰上孵育 5 分钟
9. 离心 <12,000g 4 ℃ 5 分钟 弃去上清液
10. 加入 1 ml 75% 乙醇，震荡
11. 离心 <7,500g 4 ℃ 5 分钟 弃去上清液
12. 室温下使之变透明
13. 加入 DEPC 处理水 10 μ l --35 μ l 溶解 RNA （ 可保存在液氮或低温冰箱）
14. 走 RNA 变性电泳观察 18s ， 28s 条带，分光光度计检测 260/280 吸光度比值，计算 RNA 浓度
二、 RT 反应体系（第一步）：约 20 分钟
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RNA 抽提物
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5 μ l
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Radome 引物
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2 μ l
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RNA sin
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0.5 μ l
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1. 65 ℃ 15 分钟
2. 立即放入冰浴
RT 反应体系（第二步）：约 2 小时
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RNA sin
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0.5 μ l
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10mM dNTP
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1 μ l
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5 × RT 缓冲液
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4 μ l
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25mM MgCl2
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4 μ l
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AMV 逆转录酶
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3 μ l
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1. 37 ℃ 1.5 小时
2. 94 ℃ 5-10 分钟
3. 反应物保存于 -20 ℃或进行 PCR
三 1 、 PCR 反应体系：约 4.5 小时
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25mM MgCl2
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2 μ l
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10 × PCR 缓冲液
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5 μ l
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10mM dNTP
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1 μ l
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上下游引物 10pmol/ μ l
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2.5 μ l × 2
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CDNA 模板
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2.5 μ l
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ddH2 O
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34 μ l
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Taq 酶
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0.5 μ l
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轻质石蜡油
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50 μ l
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100 μ l
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1. 94 ℃ 2 分钟， 55 ℃ 1 分钟， 72 ℃ 2 分钟 为第一个步 1 个循环
2. 94 ℃ 45 秒， 55 ℃ 40 秒， 72 ℃ 1 分钟 为第二步 30 个循环
3. 72 ℃ 10 分钟
4. 取出后 4 ℃ 5 分钟后 -20 ℃保存或走电泳
三 2 、 PCR 反应体系：约 5 小时
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25mM MgCl2
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3 μ l
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10 × PCR 缓冲液
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5 μ l
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10mM dNTP
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1 μ l
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上下游引物 10pmol/ μ l
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2.5 μ l × 2
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CDNA 模板
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5 μ l
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ddH2 O
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30 μ l
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Taq 酶
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1 μ l
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轻质石蜡油
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50 μ l
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100 μ l
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1. 94 ℃ 2 分钟， 55 ℃ 1 分钟， 72 ℃ 2 分钟 为第一个步 1 个循环
2. 94 ℃ 45 秒， 50 ℃ 40 秒， 72 ℃ 1 分钟 为第二步 40 个循环
3. 72 ℃ 10 分钟
4. 取出后 4 ℃ 5 分钟后 -20 ℃保存或走电泳
四、电泳：约 1.25 小时
1. 配 0.5 × TBE 电泳缓冲液 300 ml
2. 胶浓度 1.7% （ 40ml 0.5 × TBE 加 0.68g 胶）
3. 微波炉中火 2 分钟溶解胶
4. 冷却至 60 ℃加入溴乙锭 2 μ l （ 10mg/ml 的终浓度 0.5 μ g/ml ）
5. 放入梳子，浇板，待凝固
6. 加 8 μ l PCR 反应产物 +2 μ l 溴酚 兰
7. 电泳 50-80V （ 每� 5V ）
