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        图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        丁香园

        14446

        作为一个刚入门的科研新手时, 做 PCR 都是师兄师姐把所需引物、试剂拿来,再甩出一个 Protocol,照着程序性加样、上机就行了,感觉也没什么技术含量。轮到做自己的课题时,还真是犯了点愁,四处请教,逛论坛看各种帖子,寻找一些设计原则,最后也算形成了自己的一套流程,可以给一些还在迷茫的初学者们一些参考。

        下面以 (SOD1) 为例,一步步演示。

        基因序列查找

        一般的 PCR 所需序列可以在 NCBI Gene 上,但是甲基化发挥作用主要在启动子区域,基因序列要包含第一外显子的上游碱基,所以查找基因序列可以用 UCSU 的 Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/)。

        1. 点击 Genomes 选择对应的染色体标本

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        2. 输入基因名称

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        3. 选择基因转录本

          注意一个基因可能有多个转录本,在 RefSeq Genes 里选择你要查找的序号。

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        4. 查看基因序列

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        5. 设置参数

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        6. 点击 submit 便出现了外显子大写的的基因序列,可 copy 到 word 里保存供以后参考。

        在线设计引物

        利用甲基化设计的网站 Meth Primer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi1)粘贴基因序列。

        1. 粘贴基因序列

          包含第一外显子和上游碱基的基因序列。

        2. 设置条件

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        3. 查看结果

          网站给出的几个参考的引物相差不大,可以根据自己的需要重新设置条件来重新设计。另外可以根据一些设计引物的原则来筛选合适的引物。我也整理了一些关于引物设计的原则,供参考。

          图文并茂 | 如何为甲基化特异 PCR 设计引物

        网站给出的几个参考的引物相差不大,可以根据自己的需要重新设置条件来重新设计。另外可以根据一些设计引物的原则来筛选合适的引物。我也整理了一些关于引物设计的原则,供参考。

        参考原则

        1. 确保目标序列中有非 CpG 的 C 的个数。

          如果你没有足够的 C 位于非 CpG 内,那么未转化的 DNA 和甲基化的 DNA 看上去会差不多,以 6~7 个 CpG 为理想。如果低于这个,那么特异性会降低。你会得到非特异性的扩增,因为它区分度不够。
        2. 让产物短一点

          亚硫酸氢盐转化的过程会损伤模板 DNA,因此尝试扩增较小的片段(小于 150 bp),将得到最佳的结果。如果你通过电泳来运行产物,那么确保你能够将 M 引物的产物与 U 引物的分开。

        3. 遵守 PCR 的原则 PCR 引物设计的所有原则也适用于 MSP。

          1)引物的退火温度要相当,如果可以的话,将 M 引物和 U 引物设计成相同的条件,这样可同时运行。

          2)引物之间不要形成二聚体,一般引物自身连续互补碱基不大于 3 bp。

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