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        PCR如何有效设计引物?

        相关实验:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

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        connor312

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        3 个回答

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        土井挞克树

        有帮助

        1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
          DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

          2、引物长度一般在15-30碱基之间。
          引物长度(primer length)常用的是18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

          3、引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。
          GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4(G+C+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55-80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

          4、引物3'端要避开密码子的第3位。
          如扩增编码区域,引物3'端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

          5、引物3'端不能选择A,最好选择T。
          引物3'端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3'端最好选择T。

        user-title

        juyue2010

        有帮助

        使用引物设计软件,primer5, primer3,或者从文献里查引物

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        1、引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计

        2、引物长度一般在 15-30 碱基之间

        3、引物 GC 含量在 40%~60% 之间,Tm 值最好接近 72℃

        4、引物 3' 端要避开密码子的第 3 位

        5、引物 3' 端不能选择 A,最好选择 T

        6、碱基要随机分布

        7、引物自身及引物之间不应存在互补序列

        8、引物 5' 端和中间 △G 值应该相对较高,而 3' 端 △G 值较低

        9、引物的 5' 端可以修饰,而 3' 端不可修饰

        10、扩增产物的单链不能形成二级结构

        11、引物应具有特异性

        做 Real Time 时,用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求:

        (1)避免重复碱基,尤其是 G。

        (2)Tm=58-60 度。

        (3)GC=30-80%。

        (4)3' 端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.

        (5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。

        (6)PCR 扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在 80-250bp 之间都可;80-150bp 最为合适(可以延长至 300 bp)。

        (7)引物的退火温度要高,一般要在 60 度以上;

        要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

        PCR引物设计原则和筛选技巧

        PCR-引物设计原则 1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38。

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