抗原设计

HLA-I重链、轻链的制备（包涵体的制备）此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链，其中重链为HLA-A2分子的α链（胞外段，包括α1至α3功能区），轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP（生物素结合部位），该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后，经过原核表达而获得。【试剂及配制】（1）LB培养基（2）0.4M IPTG（3 ...

HLA/抗原肽四聚体制备技术 MHC/抗原肽四聚体（tetramer）是借助亲和素-生物素结合的原理，在体外将MHC分子（MHC-I类分子包括β2微球蛋白）及其所提呈的抗原肽组装成的MHC-四聚复合物，作为TCR结合的配体，用于检测和分离特异性T细胞。图11-1是HLA-I/抗原肽四聚体结构示意图。图示由亲和素与四个生物素化的HLA-I类分子抗原肽复合物单体结合后形成的四聚体结构，其中亲和 ...

利用HLA/抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆 免疫反应的最显著特点是其特异性，是由于免疫分子与相应的抗原表位结合具有高度特异性。利用免疫反应的特异性，能够分离出抗原特异性的淋巴细胞克隆。B细胞上BCR（或抗体）能够直接识别抗原表位，利用某种抗原表位就可以鉴定和分离相应的B细胞克隆（或抗体），过程相对简单。与B细胞不同，T细胞上TCR识别的配体是抗原肽/MHC分子复合物，而不是 ...

四聚体的制备经上述过程制备的生物素化的MHC/抗原肽复合物为单体分子，通过加入链酶亲和素，一个链酶亲和素分子有4个生物素结合位点，即可以结合4个生物素化的MHC单体分子，形成MHC四聚体。

MHC-I单体的生物素化单体HLA-1类分子必须借助于其他分子的连接才能形成四聚体，一般借助生物素-亲和素将单体HLA-I类分子连接为四聚体，这种连接方式要求HLA-I分子重链C端或轻链上能够与生物素结合。此步骤是在BirA酶（生物素-蛋白连接酶）的作用下，将生物素结合到HLA-I类分子重链的BSP位点上。【试剂及材料】1、 试剂（1）100mM 生物素（Tris-base中）（2）10 ...

浓缩MHC-I单体折叠反应物上述折叠的HLA-I/抗原肽复合物存在于1L的折叠缓冲液中，需要进行浓缩，可以采用超滤进行浓缩。【试剂及设备】试剂与材料：20mM Tris(PH8.0) Biomax 30 membrane设备： 超滤装置（Amicon 500ml Stir Cell） 带有压力调节器的氮气瓶【操作步骤】（1）按照操作程序连 ...

MHC-I单体的S300 柱层析 在上述生物素化的样品中，折叠为单体的HLA-I类分子相当于样品中S300的组分。经过S300柱层析，可从样品中分离出折叠为单体的HLA-I类分子【试剂及材料】1、 材料（1）层析蠕动泵（Hiload Pump P-50，Pharmacia)（2）紫外监视仪（Monitor UV-1，Pharmacia)（3）部分收集器（RediFrac Fracti ...

MHC-I单体的Mono Q柱层析【试剂及材料】1、材料（1）快速蛋白液相色谱装置（FPLC）（2）层析柱（Mono Q HR5/5 Column）（3）离心过滤器（ultrafree-15，ultrafree-4） （4）50ml 聚丙烯离心管（5）IEC GP8R 离心机2、试剂（1）Buffer A ：20mM Tris(PH8.0)（2）Buffer B ：20mM Tris(PH8 ...

噬菌体展示技术基本原理 噬菌体展示技术（phage displayed technology，PDT）是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。1985年Smith，G.P提出将外源基因插入改建过的噬菌体外壳蛋白基因，表达含有外源蛋白或多肽的融合蛋白，这种带有融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体。通过吸附- ...

噬菌体展示抗体库构建的载体 抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体 单链抗体（ScFv）是一种基因工程抗体，能够在原核宿主中表达，不论是在性能方面，还是在制备方面，均具有独特的优越性。关于基因工程抗体的特点与制备过程，见本书第一章的有关内容。这里仅介绍噬菌体展示技术在制备单链抗体中的应 ...

小鼠单链抗体表达库所设计的VH和VL引物VH FR1引物VL FR1引物15’-GGCTCGAGCAGGTT(G)CAGCTGC(A)AGCAGTCT(A)GG5’-CCTCTAGAGACATCCAGATGAC(A)CCAGTCTCC25’-GCTCGAGCAGGTG(A)CAGCTGG(A)T(A)GC(G)AGTCT(A)GG5’-CCTCTAGAGACATT(C)G(T)TGCTGACC ...

抗体库的构建 【材料和试剂】 （1）电转仪（2）电击杯（3）SB培养基（4）SOC培养基SB培养基经高压灭菌后，降温至60℃或60℃以下，加入20ml经过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。50mg/ml氨苄青霉素水溶液，过滤除菌。10mg/ml 卡那霉素水溶液，过滤除菌。4% PEG溶液 【操作步骤】 （1）将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min转 ...

PCR产物的酶切 经过电泳回收的PCR产物直接酶切的效果往往不佳。这主要是因为酶切位点太靠近片段两侧缺乏足够多的保护碱基。要克服这一问题要么在最初引物设计时加上较多的保护碱基要么用过量的限制内切酶长时间消化。而后者的效果并非特别理想。我们尝试首先将PCR产物互相平连再以过量限制性内切酶长时间消化得到了较好的效果。这种方案的潜在危险在于当酶切仍不完全时最后得到的片段两端很可能带有同一种酶的识 ...

PCR扩增模板和抗体可变区基因的扩增 如果构建Fab抗体库必需利用RT-PCR获取抗体基因;构建ScFv抗体库既可以DNA作模板也可以cDNA作模板。本室在构建小鼠ScFv抗体库过程中主要采用DNA作为扩增模板。【材料和试剂】（1）PCR仪（2）Taq酶（3）氯仿（4）琼脂糖【操作步骤】（1）在200μl离心管中混匀下列成分： 模板DNA 5μg 10×P ...

筛选多肽的试剂及配制LB培养基：胰蛋白胨 10g； 酵母提取物：5g； NaCl：5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，室温保存。IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。 ...

噬菌体展示技术筛选多肽 噬菌体肽库的构建 噬菌体肽库的构建多选用基因合成法，步骤类似于噬菌体抗体库的构建：即化学合成编码各种序列某一长度肽的寡核苷酸片段（如构建的肽文库是由6个氨基酸残基组成，就应含有206种不同的氨基酸序列，即约109种不同密码子的组合），然后通过DNA重组方法，插入到表达载体上的外被蛋白基因（如基因III或基因VIII）中，再利用电穿孔技术，将各种重组体转入大肠杆 ...

ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力 【材料和试剂】 （1）酶标板 （2）酶标仪 （3）0.5mol/L Na2CO3(pH9.6) （4）1％BSA （5）HRP标记的抗M13噬菌体多抗 （6）2mol/L H2SO4 【操作步骤】 (1)将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml; (2)对于要检测的每个 ...

测序模板的快速纯化【材料和试剂】（1）真空泵（2）PEG/NaCl溶液（3）碘化物缓冲液（4）70%乙醇（5）TE缓冲液 10mM Tris-HCl，pH 8.0； 1mM EDTA【操作步骤】（1）扩增噬斑（见上述），在第一次离心后，将500ml含有噬菌体的上清转入新的离心管中。（2）加入200ml PEG/NaCl，颠倒混匀，室温静置10min。（3）离心10min，倾去上 ...

ELISA检测筛选到的靶分子结合肽【材料和试剂】（1）酶标板，酶标仪（2）湿盒（3）吸水纸（4）LB培养基（5）PEG/NaCl（6）TBS（7）0.1M NaHCO3（pH 8.6）（8）HRP底物缓冲液 ABTS贮存液：在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中溶解22mgABTS，过滤除菌贮存在4℃。【操作步骤】（1）噬斑扩增上清部分用于DNA序列测定，其余保存于4℃。（ ...

抗体的命名规则 近年来，已召开过多次描述种类的来源、免疫原和抗体类型标准的大会，并加以综合简单的做了一些规定，但需要做一些解释。免疫原通常根据种类的来源确定，前面总是加前缀“抗―”。所以，如果涉及针对脊椎动物刺猬(一种从鼠演化而来的动物)的抗体，就可将试剂写成抗鼠―刺猬的抗体，或者抗鼠―刺猬的免疫球蛋白。产生抗体的种属名总是放在抗体名称的前面，如果是在大角野山羊体内产生的抗体，相应的抗体就 ...