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        四聚体的制备

        互联网

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        经上述过程制备的生物素化的MHC/抗原肽复合物为单体分子,通过加入链酶亲和素,一个链酶亲和素分子有4个生物素结合位点,即可以结合4个生物素化的MHC单体分子,形成MHC四聚体。

        【试剂及材料】

        (1)荧光标记的链霉亲和素(通常用PE标记)

        (2)经上述过程制备的生物素化的MHC单体

        (3)加样器及吸头等

        【操作步骤】

        (1)计算样品中生物素化的MHC单体的摩尔数。建议生物素化的MHC单体浓度为2mg/ml,样品体积为100μl

        (2)计算链霉亲和素中生物素结合位点的浓度。

        (3)为了进行计算,必须知道PE-链霉亲和素偶联的浓度。计算亲和素的结合位点时,要注意PE标记的链酶亲和素的浓度是指链酶亲和素本身,还是指PE-链酶亲和素偶联物,并且要注意标记的PE与亲和素分子之间的比值。

        例如,某种PE-链酶亲和素偶联物的浓度是1mg/ml,该浓度的计算依据是根据PE与链酶亲和素形成偶联物的质量,而不是依据单独链酶亲和素的质量。而且,该PE-亲和素偶联物中PE与亲和素的比值为1:1,1:1比值的PE-亲和素偶联物的分子量为300,000Da。

        每一个亲和素分子具有4个生物素结合位点,所以该PE-链酶亲和素产品中生物素结合位点的浓度应根据下式计算:

        (1mg/ml)X(1g/1000mg)X(1000ml/l)X(1mol/3000000g)×(4 生物素结合位点/mol)=1.33 X 10-5 mol/l

        计算结果即每微升(μl)该链霉亲和素产品中生物素结合位点的浓度为1.33 X 10-11 mol。

        (4)计算要加入的链霉亲和素的体积。计算时注意生物素化的MHC单体与亲和素中生物素结合位点的摩尔数要相等。举例来说:当生物素化的MHC单体为200μg时,要加入的APC标记的链霉亲和素的体积为174μl。

        (5)将需要加入的链霉亲和素分10次缓慢地加入生物素化的MHC单体中,每加一次后,等待10-15分钟。这一过程在室温下进行,且应在黑暗中进行。

        (6)将四聚体置于一个聚苯乙烯管,放进有盖的盒子中,于4 o C保存。以该法制备的四聚体可用3-6月。

        【注意事项】

        (1)MHC四聚体制备过程中,通常采用流式细胞分选仪能够识别的荧光标记物,其优点是能够买到带有这些荧光标记物的链酶亲和素,省去了对MHC/抗原肽复合物进行标记的麻烦。荧光标记物的选用取决于该标记物的标记效果(信噪比)、流式细胞分选仪要求的荧光标记物类型、可以利用的荧光抗体等。

        用PE或APC(别藻蓝蛋白)标记MHC四聚体通常能够得到很好的标记效果,但使用APC的缺点是有些型号的流式细胞分选仪不能检测APC,所以MHC四聚体的荧光标记物常用PE。

        (2)含有生物素化的MHC单体、链酶亲和素和MHC四聚体的溶液注避光保存。

        (3)将PE-链酶亲和素偶联物加入生物素化的MHC单体中时,要按照上述操作步骤(5)进行。当加入亲和素过量时,这样能够避免对MHC四聚体形成的影响,因为开始加入的亲和素上的生物素结合位点会全部与生物素化MHC单体结合,形成MHC四聚体。所以少量多次加入亲和素有利于形成最大浓度的MHC四聚体。

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