免疫组织化学实验

培养细胞的免疫酶标抗体染色法 免疫酶组织化学技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，酶催化相应的 底物，形成一种不溶性的反应产物。光镜观察时，要求形成的终产物为不溶性的有色沉淀， 而电镜观察时，则要求酶反应的终产物经适当处理后，具有较高的电子密度。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)是目前应用最多的酶标记物，具有稳定性强和酶反应特异性高等优点。 ...

组织切片的免疫酶标抗体染色法 1)4％多聚甲醛固定的组织置15％～20％蔗糖PBS中漂洗，4℃过夜或组织块下沉至 杯底； 2)制作30～40um厚的振动切片或冰冻切片，PBS漂洗； 3)2％H2O2甲醇处理，室温20分钟，封闭内源性过氧化物酶活性； 4)1％BSA室温孵育15分钟； 5)第一抗体4℃孵育12～24小时，PBS漂洗； 6)HRP或生物素标记的第 ...

免疫纳米金电镜技术基本原理 在免疫酶电镜技术中，由于过氧化物酶催化H2O2与DAB的反应产物多呈弥散分布，常使被检抗原在组织或细胞内的超微结构定位模糊不清。而胶体金免疫电镜术所用的胶体金对许多蛋白质均具有较强的亲和力，尽管研究者们尝试了用BSA等其他蛋白质包被暴露的金颗粒表面，以确保金颗粒与IgG或Fab片段之间l：l连接，但由此也导致标记探针过大，加之常用的胶体金颗粒为5～20nm，本身 ...

胶体金标抗体双重染色法 利用两种不同直径的胶体金颗粒标记两种第二抗体，在电镜下进行两种不同抗原的亚细胞定位。基本原则：首先需购买拟研究的两种抗原的特异性抗体，以及不同直径金颗粒标记的相应第二抗体，然后在同一张载网上分别或同时显示组织细胞内两种抗原所在部位。染色方法主要为包埋后染色，操作步骤与显示单一抗原的包埋后染色程序基本相同，在第一种抗体染色后，再重复上述染色过程，显示另外一种抗原成分。 ...

显微图像分析系统组成 在形态学研究中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量检测信息。如在组织化学和免疫组织化学技术中，制作了理想的标本，如何进行观察才能客观地获得尽可能多的定量信息，这是学习显微图像分析术的目的。目前，组织化学和免疫组织化学只能解决某一物质存在于何处，而不能精确地确定此物质量的多少，所谓“量”包括颜色深淡、其所占的长度或面积等，借助于显微图像分析系统(micro ...

组织化学与免疫组织化学定量分析技术 组织化学和免疫组织化学只能对组织细胞内的化学成分或抗原进行定性和定位观察：随着现代物理学的飞速发展，新理论和新技术不断涌现，发明出一批可进行定量分析的仪器，最常应用的有图像分析仪、流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜及体视学技术等，它们是现代形态学研究不可缺少的工具，它们的出现使形态学研究从定性和定位水平上升到定量分析水平。 显微图像分析系统的特点是 ...

基本术语和常用测量参数（一）像素与灰度 1．像素 是构成显示器图像的最基本单元，按行和列(X和Y)方向排列成矩列。任何一矩列均对应一个点，这些点称为像素。单位面积屏幕上像素愈多则图像愈清晰，即分辨率愈高，显示的图像也越细腻和真实。数字图像的像素越多，灰度量化等级也越多，图像分析仪分析出的结果越准确。但是。当像素达到一定量时，由于图像分析仪计算机的存储量和计算量呈几何级数增大，从而减慢了计 ...

显微图像分析处理程序 使用显微图像分析系统处理显微图像时，使用者实际操作很少，几乎完全是通过鼠标来操纵复杂的运行过程，计算机软件可按实际需要行使其功能。计算机屏幕上显示多项指令，由鼠标指明你所需要的程序即可。虽然不同品牌和不同型号的显微图像分析系统的具体性能参数不同，但在使用中基本处理过程相同．区别只在于对显微图像的不同采集参数和处理软件的设定和使用上。显微图像处理的基本过程包括制作切片样 ...

吸光和发光组织样品的常用测量参数 像素是显微图像分析系统的最小测量单位，通过它我们不仅能够得到待测范围内的几何形态信息，如面积、周长和直径等等，还可根据样品是否能够吸光或发光来测量其物质的总含量。在组织化学和免疫组织化学中常用荧光素来标记物质，使被测量物质产生有色荧光，从而进行分析。此外，在原位杂交技术中，采用放射自显影的标本也可以作为发光组织细胞样品使用显微图像分析系统进行分析。 ...

流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机和分析系统。四大系统共同完成信号的产生、转换和传输任务。检测时将待测细胞或微粒制成细胞悬液，进行荧光染色后加入样品管中。以一定压力将待测样品压人流动室，在高压下磷酸缓冲液(鞘液)从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形流束 ...

运用流式细胞仪计数细胞应注意的问题 制作组织匀浆或细胞悬液，用荧光染料染色，则可以用流式细胞仪计数不同DNA含量或倍数的细胞数。例如，在睾丸组织中，精子细胞为单倍体细胞，精原细胞、Sertoli细胞、Leydig细胞和其他非生精细胞为双倍体细胞，初级精母细胞以及处于分裂期的精原细胞和非生精细胞为四倍体细胞。因此，运用流式细胞仪测定睾丸组织各级生精细胞DNA倍体的变化，可以间接判断不同生精细 ...

激光扫描共聚焦显微镜在组织化学和免疫组织化学中的应用 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confcal microscopeLSCM)是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段相互渗透的产物。由于其高分辨率，高灵敏度及高放大率等特点，在细胞水平上能作多种功能测量和分析，如荧光定量测量、共聚焦图像分析、三维图像重建、活细胞动力学参数监测和细胞间通讯研究等，成为生物医学 ...

光学切片 激光共聚焦成像的特性使其不仅能获得胜过普通显微镜的分辨率，同时具有深度识别能力和纵向分辨率，从而可以清晰地观察较厚的标本，并可以掌握其细节。以一个最小步距0.1um的微动步进马达控制载物台升降，使聚焦平面依次位于组织标本的不同层面，可以逐层获得标本相应的光学横断面图像。这一过程称为“光学切片”，这种功能称为“显微CT”。如图所示，用激光扫描共聚焦显微镜对经过荧光染色的神经元从细胞 ...

荧光标记物的定位分析 激光扫描共聚焦显微镜可进行重复性极佳的活细胞或固定细胞的荧光定量分析。利用这一功能可对单个细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成分及分布进行定性和定量测定。 激光扫描共聚焦显微镜可以自动将荧光图像与相差图像重叠，以显示荧光标记物在形态结构上的精确定位。在同一细胞或组织标本上需同时检查两种或两种以上抗原时要进行双(多)重荧光染色。可 ...

三维图像重建 对具有三维空间立体结构的组织细胞进行研究时，尤其是定量研究其结构形态时，往往需要显示空间构造上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件将得到各光学切片的数据组合，形成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出特征性结构，产生更生动逼真的三维效果。一系列模拟荧光处理图像可被储存并以三维动画形式显示，这可谓是形态学研究方法的重大突破。激光共聚焦显微镜三 ...

定量免疫荧光测定 激光扫描共聚焦显微镜可以对经过荧光标记的组织标本共聚焦荧光进行定量分析．并显示荧光沿Z轴的强度变化。它除了可以对单、双或三重标记的细胞及组织标本的荧光进行定量、定位分析外，还可以借助显微CT功能在不损失分辨率的前提下对标本深层进行荧光分布的测量．获得组织形态结构信息。激光扫描共聚焦显微镜同样适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定，从而准确检测抗原表达、荧光原位杂交斑点及组织细胞 ...

荧光定量图像分析 激光扫描共聚焦显微镜不仅可以对生物样本进行二维和三维图像分析，还可以与荧光探针相结合，在图像处理的同时，进行图像定量分析。例如细胞面积及周长的测定和细胞核面积的测定，从而可以将生物体的形态学特征进行量化，提高了研究结果的准确性。激光扫描共聚焦显微镜能对单标记或双标记生物样品的共聚焦荧光定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化。根据实验要求设置好仪器测试的各种参数后，计算机便能 ...

激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项《一》制备高特异性和高效价的荧光抗体 标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测．制备高特异性和高效价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与高效价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定，主要是进行特异性和敏感性鉴定。《二》标本制作要求 1．标本厚度 组织切片或其他标本不能太厚，否则激发光多数消耗在 ...

体视学的基本概念 对各种生物结构的形态学研究是医学各领域研究的重要方面，尤其是定量形态学研究。对器官的整体结构水平形态学研究相对比较容易，比如用排水法测量肝脏的体积则可以清楚地了解正常肝脏与患有肝硬化病人肝脏的体积差别。但是随着科学的发展，研究者越来越关心人体在微观结构上的形态特征。任何组织结构，如细胞、细胞间质、细胞器以及某种染色阳性结构等，均为具有一定形状和空间分布的几何物体。结构的形 ...

激光扫描共聚焦显维镜定量分析的优势 激光扫描共聚焦显微镜与图像半定量分析相比，具有以下优点： 1．更精细、精确度更高。激光扫描共聚焦显微镜对免疫荧光组织化学染色样品做定量分析时，利用激光聚焦和系统软件分析对组织进行深层扫描，不破坏组织细胞结构，可深层次准确定位并精确定量。而一般图像分析只是以荧光灰度的差别变化进行半定量分析。 2．激光扫描共聚焦显微镜一般有两个以上不同波长的 ...