激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项
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激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项
《一》制备高特异性和高效价的荧光抗体
标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测．制备高特异性和高效价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与高效价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定，主要是进行特异性和敏感性鉴定。
《二》标本制作要求
1．标本厚度 组织
切片或其他标本不能太厚，否则激发光多数消耗在标本下部，而物镜观察的上部不能被充分激发。
2．载玻片 载玻片要光洁，无自发荧光；载玻片厚度应在0．8～1．2mm之间，太厚会吸收较多的光，不能使激发光在标本上聚焦。
3．封固剂 甘油必须无色透明，无自发荧光。由于荧光在pH 8．5～9．5时较亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。
《三》定量研究的要求
1．随机性
(1)在感兴趣区域内随机抽样，不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”，这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。
(2)在随机抽取的切片上，应随机抽取观察视野。
(3)在随机抽取的视野中，通过连续观察“光学切片”，得到感兴趣结构的三维定量信息。如果不能连续观察“光学切片”，需要在Z轴方向随机抽样，然后作定量研究。
2．避免参照陷阱 如果获得的资料是密度信息，当比较各组参照空间(包含待测结构的区域)的体积不同时，根据密度信息可能得出错误结论。因此，需要注意所谓的参照空间“陷阱”问题。
