western-blot

lixingliang1987 我的实验流程是：先扩增带有Flag标签的基因，再转进293T细胞进行表达，然后做western验证蛋白表达情况，但是发光后却出来好几条条带，十分困惑，请大家帮忙看看，图片附上。第一幅图是内参GAPDH，第二幅图是我的目的蛋白。lixingliang1987 自己顶一下BioGao 一抗孵育有问题吧。。。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师 ...

liuxing0626 各位学长好：我买的ProteinTECH公司的 ERK1 抗体 western blot 条带有两条，公司的说明书也是两条，请问这是个怎么情况？而且我要做ERK1/2。但是ERK2也是单买的，混起来用的话会不会出来3条带了。ERK1产品地址http://www.ptglab.com/Products/ERK1-Antibody-11257-1-AP.htmliuxing0626 123药尊 是一条比较深吧。想完全没有第二条带， ...

zhywang4072 鄙人现在做一180KD的蛋白，之前转PVDF膜用的是100v两个半小时，预染marker转得很漂亮，内参也很不错，但是目标蛋白条带却没有，请教各位大侠，这是什么原因？还有诸位大蛋白转膜时候条件怎样？我用的是湿转，谢谢wodezxn 我觉得100V2h肯定是足够了，没转上应该是你目的蛋白的问题，可能是蛋白表达量太少或者你提蛋白的时间有问题。zhibinx2007 350 mA恒流转2小时就足够了，目标条 ...

llh刘丽华 请教高手我最近做western blot，结果总是不理想，目的条带总是很淡，上样量已经是60ug了，封闭用的是5%脱脂奶粉，我还应该怎么改进哦？下面是我的结果，采用的是ECL化学发光，凝胶成像系统拍照，下面一条是我的目的条带。 麻烦各位帮帮忙吧！Mostino 转膜应充分，并提高第一抗体的使用量！成其瑞 用好点的抗体volano 我觉得你首先应拿一个别人已经做过western blot证实条带条件好的蛋白样本来做对比，排除你 ...

毛毛虫0118 我想用人血标本做WB，请问血标本最多可以放多久啊？还有做WB的话，要收集大概多少毫升血就可以了呢？毛毛虫0118 为什么没有人回复我啊？volano 建议你还是自己摸索一个量首先，不知道你要做的目的蛋白是什么？分子量有多大？是不是容易降解？如果分子量大，不容易降解，那可以储存比较长时间，如果你的目的蛋白是小蛋白那就是越新鲜越好吧，我看过师姐做的12KD蛋白，样本稍微放长些时间就悲催了其次，western blo ...

llh刘丽华 各位好：我做了1个多月western blot了，内参跑得还可以，但是目的蛋白总是跑不好，今天跑出来非特异性条带很清楚，而目的条带却很淡，不知是什么原因！前一次也是这种情况，我就延长封闭时间至2h，一抗1:700，二抗1:5000，请各位高手帮忙分析一下吧！下面是我的图片，最下面，模糊的一条（靠图片中间的一条）是我的目的条带！coffeeshine 如果非特异带很清楚，延长封闭时间没作用。你的目的蛋白和一抗的关系是 ...

心灵交流 本人想请教高手：在westernblot中煮样时需不需加上loading buffer后再煮样？以及loadingbuffer和样加的比例如何定？如6Xloadingbuffer加到样中的量如何定？谢谢zhong_cq 那是要加LOADING BUFFER, 6X的上样缓冲液，那样本与BUFFER之比为5：1（V/V）。coffeeshine 和做SDS-PAGE一样，加多大浓度、多少量的上样缓冲液视样品的浓度而定。selle ...

glacierna6 如果是做western blot，有个电转的过程，蛋白可以和NC膜比较牢固的结合。但是如果我前面步骤都不做，直接点二抗到NC膜上呢，放置10分钟，能否牢固结合？如果加封闭液，用摇床晃或者不晃，会不会把二抗从膜上晃下来（假设是没有饱和结合的）？谢谢高人指点！shb-sangon 直接点二抗到NC膜上(膜下放置滤纸），放置10分钟，自然风干，能牢固结合。用无蛋白封闭液（PW040），用摇床轻晃，不会把二抗从膜上晃下 ...

xylish1 菜鸟一枚，目前要做HER-2（膜蛋白，185KD）western blot ，求教各位，一抗哪个公司的好？使用时抗体浓度，转膜时间及注意事项，多谢！zhe992000 搭车求助，我想验证肿瘤组织中透明质酸（hyaluronan）的表达水平，这是一个糖蛋白，主要在细胞外基质中表达。在文献上一般是通过透明质酸合成酶的水平 或者透明质酸水解酶的水平来间接判断透明质酸的表达水平，我想直接测定透明质酸的表达量，不知道能不能做we ...

wx275411643 麻烦哪位高手帮助解答一下我现在做WB遇到的情况，我买的抗体说明书上写的目的条带分子量和实际曝光出来的不一样，Marker肯定没问题了，是国内公司的抗体，问过公司，他们说是蛋白被修饰了，所以会大点。我做的结果比说明书上的大了大概10KD（书上说39KD），不知道公司的解释能不能接受？抗体是多克隆的。就怕他们用别的抗体冒充我要的。zhe992000 看看你的蛋白质的分子量有没有问题？好多时候，蛋白在 ...

364587256 向各位战友求教：看过多篇英文文献，关于p-AKT的western blot检测时间，有的为1-2小时，有的却有24小时，差别之大，想知道原因。见到以前战友问过类似问题，可是关于这个时间点的把握始终弄不明白，还望实验室大虾不吝指教！ly86400 啊？我们就是用常规做法。。检测的效果还可以啊~你的检测时间是什么概念啊？364587256 ly86400 wrote:啊？我们就是用常规做法。。检测的效果还可以啊~你的检测时 ...

小瘪瘪 我现在要做细胞色素C(cyt C)的western ，买的抗体型号是SC-13156，请问有人用这个抗体么？怎么样？我要做这个，蛋白预染marker要买多大的？就是要根据cyt C的蛋白大小而定。还有就是做cyt C一抗的稀释度是多少？请有经验的前辈高手指！！yangbxys 没有做过cyt C，但是做过WB。每次买抗体，都有说明书，说明书会告诉你比如做WB时出现条带的大小，已经建议的WB稀释浓度。建议lz好好看看说明书。林杉2012 ...

huaxiflame05 各位，我的实验最近遇到了问题，检测一个趋化因子，Western 重复性很差，只有蛋白上样量接近200ug的时候才能勉勉强强看到很弱的条带，并且杂带很多。师兄建议让公司合成纯化蛋白。但问题是原核表达的蛋白分子量35kDa，在真核系统里，这个蛋白质高度糖基化，分子量可达到60kD。在这种情况下，如何构建阳性对照呢？**解答magichunter 换成单克隆抗体应该特异性更好些。另外，你不能用与实验动物相 ...

紫叶竹韵 做IP，之后Western 分析，看到有两条带，在25和50KD左右，应该是抗体的两条带，但是我的目的蛋白也是52KD的，这该怎么区分呢。woxingwosu 最好是选择与做IP不同来源的抗体来做（比如说IP用鼠的抗体，WB就用兔的抗体），这样就不会检测到抗体的两条带。如果没有不同来源的抗体的话，就要做IP的时候尽量少放点抗体，跑胶跑得远一点，使得目的蛋白能够被看到，不过由于你的蛋白是在是太接近重链了，要分开难度还 ...

familar 小妹困惑，在此请教大师！做了几次beta-catenin的表达（western），都没做出来，目的蛋白的分子量是92，可是，做出来的印记总是在下方，明显的不是目的蛋白的位置。我师兄说，做beta-catenin要提核蛋白才能做出来，可我之前也有做出来过的！请教各位有经验的同志，这样的现象是何解？woxingwosu 不一定要提核蛋白才能出来。b-catenin在核内核外都有分布。应该是你实验过程中的问题。每次 ...

owen79 各位大侠，小弟还想问一下用WESTERN BLOT检测小鼠肝脏NF-KB的时候，肝匀浆以后离心的转速和时间是多少啊？还有就是取肝脏的时候怎样把肝脏的血方的干净点啊？影响离心。haodanzhang 12000转，4°或者常温都可以。chuckdouble owen79 wrote:各位大侠，小弟还想问一下用WESTERN BLOT检测小鼠肝脏NF-KB的时候，肝匀浆以后离心的转速和时间是多少啊？还有就是取肝脏的时候怎样把 ...

yellowtree 各位大虾，我目前使用PI3K抑制剂LY294002，MEK抑制剂PD98059，JAK抑制剂AG490处理细胞后，要观察他们的抑制效果，那我该买什么抗体做western检测呢？每个信号通路都有那么多蛋白，应该选择哪一个呢。谢谢各位啦kern6549 抑制什么蛋白就检测什么蛋白。mishmoth 检测下游分子，如pPI3K的下游是Aktaileen83 一般是检测下游蛋白，如果下游蛋白因为抑制剂处理而未 ...

zhangqiang6612 最近做wb时，转膜后mark很淡，几乎没有转膜条件：300mA，恒流 45min，分子量大小40kd丽春红染膜后，条带很淡转膜液配方：Tris 5.8g，甘氨酸2.9g,甲醇200ml/L,补足液体(去离子水)至1000ml请高位高手指点蓝天飞龙 有图吗？zhanghai123 没有SDS?zhanghai123 还有1g SDSaileen83 我做western的转膜缓冲液：Tris:3g, Glycine:14.4g, ...

lingwu 做WB,加入药物，发现p-AKT在60min表达才开始上升，而其他信号分子在15min内就表现出磷酸化增加，这种现象如何解释，p-AKT在60min表达上升有什么意义？kern6549 可能是间接作用，就是药物作用后细胞分泌某细胞因子，该细胞因子通过自分泌的方式作用于自己导致p-AKT上升。lingwu 谢谢战友！这种情况能不能就排除药物的直接作用？kern6549 当然只是猜测，想要明确当然需要你进一步研究了。本 ...

hysong 配制PBST时必须要用分子级别的吗？如果用的吐温-20是普通的化学纯的会对结果有影响吗？woxingwosu 个人觉得应该影响不大吧。lijingxin198506 应该影响不大。rencuiping 配制PBST时所用试剂如：NaCl 、Na2HPO4、KH2PO4、KCl均应为分析纯，所用吐温-20是普通的化学纯不会对实验结果有影响，只是需要注意 吐温-20的浓度不同，洗涤效果不同。一般我们实验室用0.1%的。江边的麦 ...