western-blot

封闭及杂交在做杂交时，个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，这样节约抗体。操作开始：1. 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。2. 将一抗用 PBST 稀释至适当浓度（在 1.5 ml 离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保 ...

转膜篇1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。要领：（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；（2）个人感觉其实转膜之前浸湿一下就 ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好。2. ...

电泳篇开始一、清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。二、灌胶与上样1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。注意：可以用 1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左. 右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶。2. 按前面方法配 10％ 分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 10 ml 枪吸取 5 ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一 ...

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.每瓶细胞加 400 μ 含 ...

WB 实验在提取完蛋白质后，就要对蛋白含量进行测定测定方法如下：一、制作标准曲线1、从-20℃ 取出 1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、取 18 个 1.5 ml 离心管，3 个一组，分别标记为 0 μg，2.5 μg，5.0 μg ，10.0 μg ，20.0 μg ，40.0 μg。3、按下表在各管中加入各种试剂。4、混匀后，室温放置 2 min。在生物分光光度计上比色分析。二、 检测样品蛋白含量1、取足量的 1.5 ml 离心管，每管加入 4℃ 储存的考马斯亮蓝溶液 1 ml。室温放置 30 min 后即可用于测蛋白。2、取一管考马斯亮蓝加 0.15m ...

Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗体抗原之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。其基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，抗体特异性识别目标蛋白，通过酶促反应或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对蛋白进行定性或者定量研究。「良好的开始是成功的一半」，尤其对于生物学实验，如果没有高质量 ...

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白质印迹法（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物 NC 膜或 PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检 ...

Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗体抗原之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。其基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，抗体特异性识别目标蛋白，通过酶促反应或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对蛋白进行定性或者定量研究。抗体与抗原之间的特异性识别是 Western Blot 实验中最为关键 ...

Western 荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压 10~30s，看不到则同时压两张，10~30 min 洗一张，如果无则再补一张,1 h 后洗。再无，则压过夜。共 3 张片，根据每次结果调整。其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长 2~3 厘米的片子（以供贴胶带），然后剪 2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使 ...

yzzaici888 大家好，本人最近一直在做p-p38的磷酸化，但是一直都做不好。希望各位大侠帮助解决：蛋白上样量80-100ug，半干转膜70min，5%BSA封闭70min，一抗CST（#9211） 1：500加，4℃孵育过夜，二抗1:8000加室温70min。曝光出的结果很不好，杂带很多，也分析不出那条是目的条带，且没有趋势，见下图15001046419 1、上样量80-100太大了，但条带出来很浅，是不是定量有问题或者抗体有 ...

lxqsh 请教大家，以下是本人跑的WB结果图。本人不明白那一团黑的是什么回事，跟右边那个条带都不是一回事儿？如果是表达太强的话，那也最起码应该是很黑很粗类似线样的条带吧，可是我跑出来的结果就是整个泳道都是黑的。用同样的蛋白重跑了一次还是这个结果，请问是不是我的细胞或者是蛋白有问题呢？或者是还可能有什么其他的原因呢？多多指教，不胜感激！dlzhangyu 是不是忘记煮蛋白了？lxqsh 没有，所有蛋白都是统一变性的。dlz ...

zhuhuachao 请问各位战友， western-blot法测得的结果是你所要检测蛋白的总蛋白还是只包括游离的蛋白？或者说该目标蛋白与其他蛋白结合以后，western-blot法结果上是否有所反应？amygdala 一般来说，western blot检测到的是包括游离态和聚合态的总蛋白，目标蛋白与其他蛋白结合的情况下也能检测出来。能否检测取决于抗体的识别位点是否存在，通常情况下目标蛋白的抗体识别位点不会受其形成复合物影 ...

prince1101 非磷酸化抗体是识别总得蛋白的，比如AKT。P-AKT和AKT其实只差一些磷酸基，分子量稍大点，以前听别人讲P-AKT和AKT之间有shift，有时候WB是可以做出来的。用的是梯度胶？分子量在68KD左右。应该怎么样来配胶呢？梯度胶的浓度？谢谢！prince1101 希望高手能赐教！ourlab 某些 AKT抗体，如cell signaling, #9272, 不能识别磷酸化AKT，只能识别非磷酸化AKT。所以，最好用磷酸化 ...

liteng1117 求助:构建好了重组腺病毒进行蛋白表达，分子量是14kd，5%的浓缩胶70v，12%，或15%的分离胶110v，跑90min。湿转：100v，90min。封闭用5%的脱脂奶粉，封闭3h（因为背景深，以为封闭久会好些）。一抗1:3000，4度过夜，二抗1:5000，孵育1h，洗膜都是用TBST漂洗15min ×4次。但是显影后背景特别深，虽然可以看见目的条带，但还是有一些非特异性的条带出现，不知道是封闭出问题还是一 ...

已寒 各位前辈，我现在做western，NF-kB的总是出现2条带，有人说有一条是非特异性着色，但我发现两条带之间关系很密切，请看图，不同处理组的两条带中，一条升高则另一条会降低，存在这种关联性，请高手指点。sunnyun 楼主两条带是在目的条带位置处吗？我最近也做p65出来两条带，但都比目的条带小，不知道是不是降解了，我用的老鼠肝脏组织，有一个多月了，保存在-80度冰箱，楼主帮忙分析看看有没有降解的可能啊？snowden0 ...

xiayuxue 请问小分量的蛋白比如14KD,用三抗是不是更好？xiayuxue 用 三抗有什么优势啊？请大家帮帮忙，wb怎么也做不出来小分子量的roy2929 三抗一般就是放大信号吧做不出来的原因很多啊 不说详细点不好讲xiayuxue 我就是想请教大家，在什么情况下才用三抗？ronaldo_zj 楼主您好！我也做过小分子量的蛋白，大概是15kD左右吧，我没有三抗，我自己的经验是：1. 电泳的时间一定不要太长，我把积层胶制的很厚，分离胶比 ...

anlise 刚做的western，跑分离胶时发现mark的条带被拖长了，原来的线性条带变成了长方形。考虑哪些方面的原因呢？selleckchemcials 1. 可能是电流太强了， 可以考虑把电压调低一点~2. 分离胶浓度有点低，可以考虑把换成高浓度的胶~做实验的时候，为了得到漂亮的图，一定不要介意多花时间~我有的时候为了让条带好看，170KD的蛋白都用12%的胶，跑上3小时呢~当然也可能是marker质量不好，还是果断换掉比较好~ ...

夜色星辰1234 我是一个新手， western前后做了两次，均是在130-150之间出现信号很强的非特异性条带，另有少许杂带，而B-actin处信号很弱（原则上说，应在膜的中下近1/3处出现特异性条带），但却几乎看不出来（下图所示），请高手指点，不胜感激！aids610610 上样量一样吗？夜色星辰1234 aids610610 wrote:上样量一样吗？上样体积均是20ul,蛋白定量均是45ug.每次上样之前均先在沸水中煮了5min, ...

zhangyuxianggx 各位western达人，本人在western操作中屡次失败，现有几个问题跟达人们请教一下：1、我的蛋白是96kDa,选择8%的分离胶有没有问题？2、配制浓缩胶我用的是0.5M Tris-HCL(PH=6.8)，但是看到好多配方用的都是1.0MTris-HCL(PH=6.8)，这个有没有什么影响？3、转膜是用的300mA,40min，看着转膜后胶很干净，就一直用的这个电流和时间。但是最后膜上总是很乱，背景高 ...

dongfangzhizi06 我要做信号通路(ERK和p38)，请问多少数量的细胞可以提磷酸化蛋白做western blot检测p-ERK1/2和p-p38？六孔板的一个孔够吗？谢谢！民间恺撒 上次我接板时的密度是5×105，提了四个孔的总蛋白，大概浓度在8.5左右。建议6孔板可以使用两个孔叠加在一起，这样蛋白浓度会有所保证。bianbenjamin 我都是六孔板一个孔做的，为了保证蛋白浓度，少加点裂解液即可，我一般是60-80微 ...