甲基化PCR

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施【嘉美生物】亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0～3.9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0；(2)修饰时间应 ...

最近因为发现一个gene在多种肿瘤中被silenced, 我也在做DNA甲基化. 这里把我折腾1个月的经验和大家分享:)1. Genomic DNA extraction这一步其实也很重要,尤其是对tissue来说. 大家知道DNA hypermethylation会导致chromatin结构紧密, 所以这一步尽量去除DNA结合的蛋白很重要. 我们实验室常用Qiagen的两个kits效果都不是太好,最后还是用proteinase K处理后酚提醇沉 ...

高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM ...

求助坛内有经验者：在DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的准备工作时候，遇到了一些困难。先不提DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的意义了。1.应该说甲基化特异PCR是1996年开始的，原始论文：Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (见下贴附件)。其中关于DNA的Bisulfite处理见本贴附件。2.而在《Curre ...

甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互 补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。MSP 实验流程： 抽提基因 ...

关于MSP，园子里的讨论帖子不少，但很多战友还是跑不出条带。此帖结合本人的亲身经历，就MSP提些建设性的意见，谨奉献给仍奋斗在一线的战友们。先简要的说说MSP法的原理，即用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，然后通过电泳图检测甲基化状态。本人研究的课题是一个常见的抑癌基因，前期的研究发现此基因的表达 ...

大伙好，我购买Chemicon公司的CpGenome DNA Modificatio Kit 打算五月开始做，希望以后一起交流一下甲基化分析的实验技术。QQ：395848659Here are some online resources for methylation studyCpG island prediction:CpG Island SearcherCpG PlotMethPrimerCpGProD (CpG Island Promoter Detection) newCpG ...

大家都知道,做MSP亚硫酸盐处理后,需进行纯化,我用的PROMEGE的DNA cleanup试剂盒,按它推荐的方法,每1ugDNA需纯化树脂1ml,而经过我查的文献和反复实验发现,1-2ugDNA用100ul树脂就够了,当然不再是按它的步骤,现将我的步骤公布如下,希望对大家有所帮助:1. Take 1 -2 ug of DNA and add double-distilled water to 50 mL in a 1.5-mL tube.2. Add 3.5 uL of 3 M NaOH (final concentr ...

发表在Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkn294Advance Access published online on May 16, 2008文章地址 http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/gkn294v1摘要：Bisulfite sequencing, a standard method for DNA methylation profile analysis, is widely used in ...

甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。第一部分 基因组DNA的提取。这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者 ...

荧光定量PCR技术研究进展多聚酶联反应（PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于获取特定基因或基因片段及临床基因诊断等领域。早期最成功及普及的应用领域是获取某一目的基因，用于基因诊断有许多局限性，主要有两点，一是不能准确定量；二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术（FRET）就用于PCR定量 ...

Methylation-Specific PCRProtocol written by James HermaundefinedMethylation-specific PCR (MSP) is a simple rapid and inexpensive method to determine the methylation status of CpG islands. This approach allows the determination of methylation patterns from very small samples of DNA, i ...

甲基化特异PCR（Methylation-specificPCR）资料大全关键词：甲基化特异PCR、DNA甲基化、Methylation-specificPCR、甲基化特异PCR文献、甲基化特异PCR引物设计、甲基化特异PCR实验注意事项第一部分：甲基化特异PCR文献5 undefined A! Y" w1 g8 \$ W9 E8 {/ undefined V; t! Z: undefined Q6 ^+ Q4 c( l7 U( F' g, b8 o. K- j: w% a. ?: o7 第二部分：实验protocol第三部分：甲基化引物设计http://www.urogene.org/methpr ...

做了点甲基化研究，从头下来，也有一点点体会。也看了院子里不少牛人的新的体会。本人将每一个步骤的具体操作、每个操作的具体注意事项和心得进行初步总结，慢慢叙来，抛砖引玉，欢迎拍砖。 做到现在，有成功的喜悦，也有失败痛苦，且行且歌，总得来说，BSP/MSP，想说爱你不容易。 如有时间，想谈谈：BSP/MSP引物设计；基因组海量甲基化数据分析；MSP设计及操作；当前MSP的研 ...

一、基因组DNA的提取。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20 mg/ml； 2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10 mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消 ...

MLPA(Multiples ligation-dependent probe amplification)，多重连接依赖探针扩增，是一种在同一反应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化的方法。MLPA可以快速同时鉴定几十个基因的缺失和插入，可用于血液，肿瘤样本的DNA，mRNA的表达谱分析。而且，MLPA方法可用于甲基化分析。MLPA已经证实是可信而可靠的方法，目前已广泛应用于全世界900多 ...

差异性甲基化杂交(DMH) 1)微阵列构建 (1)基因组片段化：将雄性个体(雄性个体包括完整的染色体，即含有Y染色体)基因组DNA经MseI消化(MseI识别位点为TTAA，可以保证富含CpG的片段不被破坏)成约200bp的小片段，而CpG岛仍然保持相对完整。 (2)去除富含甲基化CpG的高度重复序列：如上所述，在正常组织或细胞中，5mC多发生在高度重复序列，使得这些重复序列得 ...

甲基化特异性PCR(MSP) 1)MSP原理：MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。MSP示意图注：①亚硫酸氢钠处理；QPCR 此原理的关键在于3对特异引物的设 ...

基因组非特异性甲基化水平的研究 1．3H―SAM掺入后液闪检测法 (1)将约2ug基因组与足量3H标记的SAM，甲基化酶(Sss工或HpaⅡ)共同温育，SAM的甲基化基团将被掺人到目的DNA中未甲基化的胞嘧啶上。 (2)以WhatmanDE81滤纸过滤此温育混合物，并以液闪缓冲液淋洗去掉未结合的3H标记的SAM，以液闪检测该滤纸上结合的’H标记的SAM量。如此值较高，则提示原来 ...

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败。