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        甲基化PCR检测方法

        互联网

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        一、基因组DNA的提取

        此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

        使用两者的细节:

        1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20 mg/ml;

        2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10 mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。

        3. 验证提取DNA的纯度的方法有二:

        (1)紫外分光光度计计算OD比值;

        (2)1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

        二、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

        如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。

        1. 将约2 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀释至50 ul;

        2. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH;

        3. 42℃水浴30 min;

        水浴期间配制:

        4. 10 mM 对苯二酚(氢醌),加30 ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)

        5. 3.6 M 亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88 g 亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3 M NaOH滴定溶液至pH 5.0,最终体积为5 ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。pH一定要准确为5.0。加520 ul 至上述水浴后溶液中。

        6. EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。

        7. 加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。

        8. 50℃避光水浴16 h。

        一般此步在4 pm开始做,熟练的话不到5 pm即可完成,水浴16 h正好至次日8 am以后收,时间上很合适。

        这一步细节:

        (1)基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。

        (2)所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。

        (3)亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

        (4)水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。

        三、修饰后DNA纯化回收

        EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。

        1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5ml EP管中。

        2. 以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统(Promega,A7280)

        (1)70℃水浴预热DDW;配制80%异丙醇;

        (2)加1 ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合;

        (3)由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便;如果没有,需要自备3 ml~5 ml 注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2 ml 以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

        (4)将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2 ml 80%的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。

        (5)将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5 ml 洁净EP管上,离心12 000 rpm,2 min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥。此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态。

        (6)将小柱取下置于另一洁净1.5 ml EP管上,移液器加50 ul 预热好的DDW,室温放置5 min。

        (7)离心12 000 rpm,20 s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50 ul。

        3. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH,室温放置15 min。

        4. 加33 ul 10 M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液pH于7.0左右。

        5. 加4 ul 10 mg/ml 糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说。不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧

        6. 加270 ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验。如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧。

        7. 4度,12 000 rpm 离心,30 min,倒去上清液,收集沉淀。不必吸净。

        8. 加500 ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12 000 rpm,5 min。离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍。此为洗涤步骤,共2次。

        9. 倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5 min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20 ul~30 ul DDW,溶解沉淀。至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验。

        10. -20℃保存DNA溶液。

        此步细节:

        (1)在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用。

        (2)乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出。

        (3)异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便。

        此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的pH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了。


        四、修饰后DNA用于PCR
        这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题:

        1.  引物问题:我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题。如果不是这样,还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询。查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强。我也是按此行事,算比较顺利。

        2.  Taq酶问题:有文献用高保真的金牌Taq(Platinum),但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg2+的LA缓冲液。有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择,可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。

        3.  PCR的条件:变性一般都选择95度,3 min。其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。

        4.  做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行。

        5.  PCR仪:如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递。
         
        五、PCR产物的凝胶回收
        这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品(用过)。把切下来的胶按说明书操作即可。

        细节:
        1.  PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
        2.  凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性。
        3.  紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤。
        4.  回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的。
         
        六、PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
        1.  连接T载体(本实验使用的是Promega的试剂盒)
        15 ul 体系
        T-easy 1 ul
        Ligase 1 ul 
        2×buffer 7.5 ul 
        DNA 5.5 ul
        4度,过夜。  

        2.  连接产物的转化
        (1)-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上;
        (2)连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟;
        (3)42度, 90秒钟;
        (4)冰上2分钟;
        (5)800 ul LB培养基;
        (6)280 rpm,37度,摇床45分钟(将管放水平了摇,保证菌液摇匀);
        (7)8 000 rpm,1分钟;在超净台内去上清,留100~150 ul;
        (8)涂板:37度孵箱过夜;(板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基)
        先涂:X-gar 35 ul
        IPTG 25 ul 
        后涂:混悬液 
        过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低。

        3.  取白斑,划种于新板上
        新板:先涂:X-gar 35 ul
        IPTG 25 ul 
        然后于板底划出分区,进行标记。根据需要,一般一板作50个克隆没有问题。 
        针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
        37度,孵箱过夜。

        4.  联系测序公司送测序。一般一个克隆在35~45元。
        这一部分的细节:
        (1)涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上;
        (2)不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个。
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