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        MLPA方法与遗传疾病检测

        互联网

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        MLPA(Multiples ligation-dependent probe amplification),多重连接依赖探针扩增,是一种在同一反应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化的方法。MLPA可以快速同时鉴定几十个基因的缺失和插入,可用于血液,肿瘤样本的DNA,mRNA的表达谱分析。而且,MLPA方法可用于甲基化分析。MLPA已经证实是可信而可靠的方法,目前已广泛应用于全世界900多个实验室,使用该技术发表的论文已近千篇。

        MLPA目前的应用领域:

        1.检测小的重排:BRCA1,BRCA2,MSH2,MLH1,DMD,APC,SMA,NF1,NF2,VHL,TSC1/2,MECP2,NSD1,LDLR,FBN1,CFTR,DPYD,COOL5A1,CACNA1A,PKHD1,BRIP1,SLC26A4,LNM1B,PRSS1,FRMD7,TPMT,FLCN,DNAI1,EP300,DNAH5,UBE3A,PCCA,PCDH15等。

        2.检测大范围的染色体重排:williams syndrome,prader-willi/angelman syndrome,digeorge syndrome,cri du chat,pelizaeus-merzbacher,CMT1,HNPP等。

        3.检测亚端粒区的拷贝数改变。

        4.检测染色体非整倍体改变,(包括羊水样本)。
        5.肿瘤诊断:ALL,CLL,Oligodendrogliomas,melanomas,neuroblastomas等病的拷贝数改变。

        6.甲基化定量检测:Parader-willi、angelman syndrome,beckwith wiedemann,MGMT,MLH1,Fragile X,抑癌基因的失活。

        7.mRNA分析细胞凋亡和炎症反应。

        MLPA的特点:

        1.基于PCR的反应,一个反应同时检测多达50个基因组DNA序列的拷贝数。

        2.样本量要求:只需20 ng 人DNA,羊水0.5 ml 约3000个细胞。

        3.能区分一个碱基的差异的核酸序列。

        4.反应条件优化,所有试剂盒基本适用同一反应条件,试剂盒包含了所有必需试剂。

        5.高通量:24小时内得到结果。

        6.仪器要求:只需普通PCR仪和测序仪。

        7.检测范围:从点突变到大染色体缺失/插入均能检测。

        MLPA反应条件(one-tube MLPA protocol):

        1.DNA变性:98度加热5分钟。

        2.杂交:加入SALSA探针混合物和buffer于95度孵育1分钟,然后于60度杂交16个小时。

        3.连接:加连接酶和buffer于54度孵育15分钟。再于98度加热5分钟使连接酶失活。

        4.加引物:dNTP,聚合酶,然后开始PCR扩增。

        5.毛细管电泳:输出片段长度和峰面积,软件分析结果。

        MLPA的优点:

        1.MLPA技术能用于检测许多不同的疾病,差别只是探针不同而已。

        2.MLPA是多重反应,一个反应提供了将近50个靶位点。

        3.MLPA反应费用较低。

        4.MLPA重复性好,简单易操作,可以同时检测多个样本。

        5.MLPA敏感性高,仅需20 ng 人DNA,结果不受样品DNA量的影响。

        6.MLPA能区分单个碱基的差异,能检测少量的拷贝数改变,如2个,3个拷贝数改变。

        7.MLPA可以检测单一外显子的缺失和插入突变。

        8.所需仪器易得到

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