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        BSP/MSP:想说爱你不容易

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        甲基化研究

        做了点甲基化研究,从头下来,也有一点点体会。也看了院子里不少牛人的新的体会。本人将每一个步骤的具体操作、每个操作的具体注意事项和心得进行初步总结,慢慢叙来,抛砖引玉,欢迎拍砖。

        做到现在,有成功的喜悦,也有失败痛苦,且行且歌,总得来说,BSP/MSP,想说爱你不容易。

        如有时间,想谈谈:BSP/MSP引物设计;基因组海量甲基化数据分析;MSP设计及操作;当前MSP的研究进展,等等吧……

        1. 确定目的基因后,登陆网址UCSC Genome Bioinformatics

        2. 选网页左边的:Genome Browser后,进入基因检索界面

        3. 在Assembly下拉菜单选择:Mar.2006

        4. 在position or search term 输入基因名称,如APC后,submit

        5. 在RefSeq 里面选择你的基因,如这里较多亚型时,最好参照您的NM_000000进行选择;如没有,调最长的isoform,点击之

        6. 此时进入附图画面,在左边你可以看到标记蓝底的APC基因,点击之,进入下一界面

        7. 在links to the sequence里面,选择Genomic sequence

        8. 点击进入后,可在Promoter/Upstream by里面根据需要填个数值,比如500

        9. submit 后进入基因系列

        10. 大些字母处即为转录起始处,transcription start site,TSS

        11. 从头开始,选定基因序列至完全涵盖TSS,可以长点,复制

        12. 打urogene

        13. 在复制框里面黏贴

        14. 选择你要的引物类型,如Bisulfite Sequencing,点击submit

        15. 可看到参考引物,按你感兴趣的位点选择引物即可。引物的具体信息下面会有详细介绍。

        BSP:

        BSP 主要目的是,通过测定亚硫酸盐修饰后的DNA序列,了解特定基因的具体CpG位点的甲基化情况。而MSP只能获得该样本是否发生甲基化的信息,BSP则可以详细了解每一个CpG位点的甲基化情况。
        1. 首先,按前帖设计引物后,确定BSP反应条件。我们实验室一般都做45个cycle.提个有意思的题外话,通常BSP的退货温度,会比相应的MSP的退货温度低。
        2. BSPCR后,取10ul跑PCR,如条带单一,则直接克隆,具体操作按照Invitrogen的TOPO试剂盒进行;如条带有杂带,需要进行PCR Screen,具体操作及原理以后再讲;
        3. 克隆后在LB胶上,培养过夜后,后通常取8-12个克隆,LB培养过夜;
        4. 过夜后LB液浑浊;按照5-Primer的Mini Plasmid DNA提取试剂盒操作说明,提取质粒DNA;
        5. 半量反应后,送Genomic Core测序;
        6. 测序结果报告用FinchTV软件阅读(可用GOOGLE搜索后在线注册下载安装),寻找出目的片段后,建立每一个克隆序列的TEXT文章(后续的BiQ Analyzer用这个文件导入)。
        7. 将上述文件导入BiQ Analyzer后,按研究需要质控,最后生成BSP直观图。
        (因上述各个试剂盒及详细的实验操作规范都是英文的,我就不一一翻译了。而相信国内的买的试剂盒都有相应的中文说明,可以查阅)

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