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        【分享】MSP(甲基化特异性PCR)介绍

        丁香园论坛

        14902

        甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法.MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。

        然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互 补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高,应用范围广。

        MSP 实验流程:

        抽提基因组DNA,并定量

        (组织、细胞、全血、血浆/清等)

        亚硫酸氢钠处理DNA

        (pH5.0 50℃ 8-16hr所有试剂新鲜配制)

        DNA修饰后纯化回收

        PCR/Real-time PCR检测(引物、退火温度)

        琼脂糖凝胶电泳/拷贝数

        难点:

        1、 实验流程长,操作烦琐,不易控制;

        2、 起始DNA量不能太多,否则修饰不完全;但量太少,在漫长的修饰、回收过程中容易丢失,所以要求熟练而精细的实验操作。

        3、 修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置,并且需要反复摸索找出合适的反映时间。

        4、 PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都需要不断优化。

        总之,在MSP过程中,影响结果的因素比较多,想要得比较好的实验结果,不仅要求高质量的实验试剂,更要求丰富的实验经验和良好的实验习惯。

        迪奥生物凭借多年分子生物学实验经验和稳定的技术平台,还有数百例MSP的成功经验,已经建立了 Taqman 探针法检测基因启动子甲基化的技术体系,并且在临床应用方面与多家医院建立了稳定的合作关系!

        使用仪器:美国应用生物系统公司(ABI)VeritiTM梯度PCR仪

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