RT-PCR

基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中 所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术 的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打 点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述 ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b ...

差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENECHIP等。简单介绍如下：DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；②在逆转录酶作用下 ...

我做大鼠肝组织TNFalpha受体的表达，用退火温度52，40个循环都做不出，为什么？它的表达量应该很丰富的呀，会不会RNA降解了，但内参跑出来了（240bp），是不是我从文献上查的引物有问题，请高手帮验证一下；TNFR1 NM_0130911 ttttctccga gttttctgaa ctctggctca tgatcgggct tactggatac gagaatcctg61 gaggaccgta ccctgatttc catctacctc tgac ...

我做半定量RT-PCR分析,不知道用哪个数据？软件是Quantity One结果：Gel name : 505 2005-04-14 11hr 31min (Raw 1-D Image)IndexNameVolumeAdj. Vol.% Adj. Vol.ConcentrationDensityINundefinedmm2INundefinedmm2INT/mm21U13315.0229129164 990.4582083559 6.1992842653N/A1284.83848788572U24154. ...

我是一名新手，最近准备做一项RT-PCR检测小鼠脾组织含某种病毒的工作，刚接触分子生物学，在丁香园上看了诸多帖子，感觉是受益非多。但由于没有实践，很多东西仅停留在感性认识，有些还不怎么懂，希望得到前辈的帮助。1.脾组织的磨碎：我询问并参观了学校的有关老师的做法：在用Triol提的时候，是把脾组织称取50mg放入1.5ml离心管内，加入提取液后，然后用眼科剪剪碎，之后用手拿离心管按在磁力涡旋混匀器打悬，由于剪刀一下很 ...

做半个月RT-PCR了，内参条带没问题，可是目的基因始终不露面。使我的模板有问题马？下面是我测得总RNA的OD:0.133{A230}、0.270{A260}、0.133{A280}、0.08{A320}.A260/A280=2.03 、A260/A230=2.03我得模板零下80放了一年多，现在做RT-PCR，退火温度、镁离子浓度、循环数都试过来了，老是不出结果，我都不知道下部要怎么做了。。。。郁闷死了。下面使我的试验步骤， 烦请各位高手帮帮 ...

我要扩增一种逆转录病毒（)的某段基因。将这段基因用RT-PCR方法扩出来后，再用pcDNA3.1转到Hela细胞中，观察它对细胞一些表达产物具有正向还是负相的调节作用。基因序列如下：1 atggaacaag ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc cacacaatga atggacacta61 gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcctaggat ttggctccat121 ...

我想作RT-PCR，扩一个长度为1352kb的基因，用pcDNA3.1作载体表达。我要得到cdna全长，不知道应该怎么设计引物和酶切位点。mrna序列如下CAGGCTCTGTGTTGGTTGGAGCGAGCATGTGGGTCTGCAGTACCCTGTGGCGGGTGCGAACCCCGCCCGGCAGTGGCGGGGGCCTGCTCCCAGCTTCTGGCTGTCACGGACCTGCCGCCTCCTCCT ...

要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c： ...

各位好！我是分子生物学实验的新手。我的课题的第一步是要用RT-PCR获得全长的cDNA（接到pMD-18上）,我用如下引物的话是不是无法得到所要的目的序列？因为primer5.0的评分很差的。各位好朋友能否帮帮我？Genebank Accession Number :AF144325gene:1...1758cds: 100....17311 aggagaaaag ggcgctgggg ctcggcggga ggaagtgcta gagctctcga ct ...

PCR/RT-PCR疑难问题解答（一）［ 作者：佚名 转贴自：210.83.8.237 点击数：23 文章录入：kay76 ］一、问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因：1．RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否 ...

一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌 ...

大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2哪C（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2哪C（t）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试 ...

作者Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy11U. S. Food and Dru g Administration, Center for Veterinary Medicine,Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. 2U.S. Food and Dru g Administration, Center for Dru g Evaluation andResear ...

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基 ...

在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题，实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我为什么总是提他们？因为还是很佩服的哦，生怕自己说错了，被他们指出来哦）都谈到了很多，鄙人也充大头答了一些问题，但是还是有各种问题，由于的基因表达还有点实战经验（但也技止此而），所以想写点东西给大家参考，计划把包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR都写了，但是实在时间不 ...

在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Se ...

一、RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 二、RT-PCR具体步骤 详细参考：RT-PCR ...

一、知识背景： 1、基因表达：DNA——RNA——Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因——104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）——共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PC ...