荧光定量PCR详细流程和问题解析（四）

大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过 2-ΔC'T来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用 2-ΔC'T 来计算了。这是错误的，会得到错误结论。

无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。

不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。

最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。

每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。

在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。

其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。